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植物组织培养复习资料

发布时间:2019-09-19 23:44 浏览次数:

  组培复习资料 第一章 绪论 1 、植物组织培养:是指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体,放在人工控制的无菌环境条件下无菌环境条件下培养,使其生长、分化并成长为完整植株的过程。 2 、植物细胞组织培养:指在 离体(in vitro)条件下利用 人工培养基(medium)对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养,使其长成完整植株的过程 3 、组织培养材料:◆器官:根、茎尖、叶、花、果实、种子等◆组织:形成层、表皮、皮层、胚、胚乳等◆细胞:大孢子、小孢子、体细胞◆原生质体 基本特点: 无菌、 离体材料、人工培养基与培养环境 4 、根据组织培养材料...

  组培复习资料 第一章 绪论 1 、植物组织培养:是指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体,放在人工控制的无菌环境条件下无菌环境条件下培养,使其生长、分化并成长为完整植株的过程。 2 、植物细胞组织▷•●培养:指在 离体(in vitro)条件下利用 人工培养基(medium)对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养,使其长成完整植株的过程 3 、组织培养材料:◆器官:根、茎尖、叶、花、果实、种子等◆组织:形成层、表皮、皮层、胚、胚乳等◆细胞:大孢子、小孢子、体细胞◆原生质体 基本特点: 无菌、 离体材料、人工培养基与培养环境 4 、根据组织培养材料分类:器官培养、茎尖分生组织培养、愈伤组织培养、细胞培养、原生质体培养 5 、组织、器官或细胞培养:指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养,使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。 6 、愈伤组织: 指在人工培养基上由外植体(explant)形成的一团无序生长的薄壁细胞。 7 、外植体(explant): 在植物组织培养中,由 活体(in vivo)植物★◇▽▼•体上提取下来,接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。 8 、脱分化(dedifferentiation):一个成熟细胞或分化细胞转变成为分生状态的过程,即形成愈伤组织的过程。 9 、再分化(redifferentiation):植物成熟细胞经历了脱分化之后,即形成愈伤组织之后,由愈伤组织再形成完整的植株的过程。 10 、原生质体培养:指将微生物或植物细胞游离成原生质体,在适宜培养条件下,依据细胞全能性使其再生细胞壁,并进行细胞分裂分化,形成完整个体的技术。 11 、培养方式:固体培养、液体培养◆培养物量:大量培养、微量培养◆培养过程中是否需要光: 光培养、暗培养◆培养方法不同: 平板培养、微室培养、悬浮培养、单细胞培养◆培养器官的不同:花药培养、胚珠培养、根培养、茎尖培养 12 、细胞全能性(cell totipotengcy)学说:植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组,在一定条件下具有发育成为完整植株的潜在能力。 第二章 3 节外植体的选择和灭菌 1 、外植体的选择:植物组织培养的主要作业大致包括:外植体的选择、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。(1) 选择优良的种质:选取性状优良的种质,或特殊的基因型(2) 选择健壮的植株:选取发育正常的器官或组织(3) 选择最适的时期(4) 选取适宜的大小:一般选取培养材料的大小,在 0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料,则应更小。 2 、外植体的灭菌方法:预处理方法:先对植物组织进行修整,去掉不需要的部分,将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。常规的表面灭菌处理方法:①把材料放进◆●△▼● 70%的酒精中约 30s。②用 0.1%的升汞(HgCl2)中浸泡 10min。或用 10%的漂白粉上清液中浸 10min~ 15min。③无菌蒸馏水冲洗 3~5 次。④灭菌时进行搅动,使植物材料与灭菌剂有良好的接触。⑤在灭菌剂里滴入数滴 0.1%的 Tween20(吐温)或 Tween80 湿润剂,则灭菌效果更好。 3 、污染原因和预防措施:污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败的现象。(1)细菌污染的特点:菌斑呈粘液状物,而且在接种后 1~2 天即可发现。 污染的原因:①材料带菌②培养基灭菌不彻底③操作人员未遵守操作规程。因此接种人员的手应经常用 70%洒精擦净,镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。(2) 真菌污染的特点:污染部分长有不同颜色的霉菌,在接种后 3~10 天才能发现。原因:①周围环境不清洁②超净工作台的过滤装置失效③培养用器皿的口径过大等。解决方法:为了减少损失,提高工作效率,必须在每个操作环节注意防止污染的发生。(3)污染的预防措施:a.发现污染的材料应及时处理,否则将导致培养室环境污染。b.对一些特别宝贵的材料,可以取出再次进行更为严格的灭菌,然后接入新鲜的培养基中重新培养。c.要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前,先集中进行高压灭菌,再清除污染物,然后洗净备用。 4 、污染的几个预防措施: 1)防止材料带菌的措施:①用茎尖作外植体时,可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养②选择合适的时间去田间采取外植体。 2)外植体的灭菌:①多次灭菌法②多种药液交替浸泡法。 3)玻 璃器皿的灭菌:①湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌,灭菌时间可延长达25min30min。②干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。③煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。 4)金属器械的灭菌:①火焰灭菌法②干热灭菌法 5)布质制品的灭菌:湿热灭菌法 6)无菌操作室的灭菌 7)操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行 章 第二章 4 节外植体的接种和培养 1 、外植体的接种:是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞,并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污染,主要由空气中的细菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外,应特别注意防止工作人员本身引起的污染。 2、 外植体的培养条件: 光照、温度、湿度、氧气和培养基的 pH 值等。①光照: 普 通培养室要求每日光照 12h-16h,光照强度 1000lx-5000lx ②温度:培养室一般所用的温度是 25C2C.③湿度: 要求室内保持 70%-80%的相对湿度。④氧气 3、外植体的褐变及其预防措施:(1)什么叫褐变?褐变是指外植体在培养过程,自身组织从表面向培养基释放出褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。(2)褐变的原因是什么?褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。但酚类很不稳 定,溢出过程中与多酚氧化酶接触,在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水,醌类又会在酪氨酸酶等的作用下,与外植体组织中的蛋白质发生聚合,进一步引起其他酶系统失活,从而导致组织代谢紊乱,生长停滞不前,最终 衰老死亡。(3)▲★-● 影响褐变的因素有哪些?随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同,褐变的程度也有所不同。 4、影响褐变的因素:1)植物材料①基因型②材料年龄③取材部位④取材时期 ⑤外植体大小及受伤害程度 2)培养条件:主要是光照与温度。温度过高或光照过强,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速外植体的褐变。3)培养基:①培养基状态:液体培养基可以有效克服外植体褐变,液体培养基再加上滤纸桥,效果就更好 ②无机盐 ③植物生长调节物质 ④抗氧化剂 ⑤吸附剂 ⑥pH 值 4)材料转瓶周期 5、褐变的预防措施有哪些?⑴选择适宜的外植体 ⑵采用适宜的培养基和光温条件 ⑶在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 ⑷缩短转瓶周期 第二章 5 节玻璃化、驯化与移栽 1、玻璃化现象第二章 5 节玻璃化、驯化与移栽 1、玻璃化现象:是指组培苗出现叶、嫩梢 呈水晶透明或半透明, 植株矮小肿胀, 失绿,叶片皱缩成纵向卷曲,脆弱易碎;叶表皮缺少角质层蜡质,没有功能性气孔,不具有栅栏组织,仅有海绵组织; 体内含水量高,但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。 2、玻璃化的原因:细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。(一) 激素浓度:细胞分裂素浓度提高(或细胞分裂素与生长素比例高),易导致玻璃化苗的产生。 (二)琼脂浓度:培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加,水浸状严重,苗向上长, 琼脂的浓度一定要适当。(三)温度:温度越低玻璃化苗的比例越高(四)光照时间 (五) 通风条件:(四)光照时间 (五) 通风条件:气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类 (六)离子水平 3、预防玻璃化的措施:(1)适当控制培养基中无机营养成分 ⑵适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 ⑶适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 ⑷增加自然光照,控制光照时间 ⑸控制好温度 ⑹改善培养器皿的气体交换状况 ⑺在培养基中添加其它物质 4、试管苗的生态环境:组织培养中培育出来的苗通常称试管苗或组培苗。由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培养器皿中,与外界环境隔离,形成了一个独特的生态系统。与外界环境条件相比具有以下 4 大差异,即高温、高湿、弱光和无菌高温、高湿、弱光和无菌。⑴高温且恒温:通常温度控制 25℃2℃(2)高湿(3)弱光(4)无菌 5、试管苗的特点:第一,试管苗生长细弱,茎、叶表面角质层不发达;第二,试管苗茎、叶虽呈绿色,但叶绿体的光合作用功能较差;第三,试管苗的叶片气孔数目少,活性差;第四,试管苗根的吸收功能弱 6、试管苗的驯化:(一)驯化的目的:在于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试管苗健壮,最终达到提高试管苗的移栽成活率。(二)驯化的原则:应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境 要素进行,驯化开始数天内,应和培养时的环境条件相似;驯化后期,则要与预计的栽培条件相似,从而达到逐步适应的目的(三)驯化的方法:驯化一般在试管苗移栽前进行,首先进行移栽前的驯化锻炼即 炼苗(练苗),其具体方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室转移到 半遮荫的自然光下进行锻炼,在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度,并打开瓶盖 注入少量自来水使幼苗逐渐 降低温度,转向有菌,这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。驯化一般进行 1~2 周。 7、试管苗的移栽:试管苗的移栽往往和驯化同步。移栽的方法有: 常规移栽法、直接移栽法和 嫁接移栽法。试管苗的嫁接移栽法与常规移栽法相比具有许多优点 8、影响试管苗移栽成活率的因素: 包括内因与外因:⑴试管苗的生理状况(选择壮苗)⑵植物生长调节物质 ⑶无机盐浓度 ⑷活性炭 ⑸环境因子 ⑹从无菌向有菌逐渐过渡 第二章 12 节组织培养实验室及操作技术 1、灭菌方法第二章 12 节组织培养实验室及操作技术 1、灭菌方法:⑴物理方法:物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。⑵化学方法:消毒剂、抗菌素灭菌 2、⑴培养基灭菌:高温高压湿热灭菌法:压力在 9.8×10410.8×104Pa,温度在 121℃,灭菌 2030min(2)玻璃器皿灭菌:蒸汽高压消毒灭菌,干热消毒灭菌(3)塑料器皿灭菌:多采用 高压蒸汽消毒灭菌(4)金属用具灭菌: 灼烧灭菌浸入 95%酒精,后置于酒精火焰上灼烧,冷却后使用(5)接种室灭菌(6)外植体灭菌 3、无菌操作:⑴消毒,更换实验服、帽子与鞋子,进入接种室。⑵打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯,照射 40min 左右,后关闭。⑶开启过滤室风机,使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。⑷用 70%75%的酒精擦拭工作台和双手⑸用沾有 70%75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿,放进工作台。⑹把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在 95%的酒精中,再在火焰上消毒,放在器械架上。⑺在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。⑻打开瓶口,用火焰烧瓶口,转动瓶口使瓶口各部分都烧到。⑼取下接种器械,在火焰上消毒。⑽把培养材料放入培养瓶,盖上瓶口。⑾接种结束后,清理和关闭超净工作台 4 4、 植物组织培养所需的环境条件及营养成分:㈠所需环境条件:⑴ 温度:植物材料一般最适温度在 252℃之间 ⑵光照:最常用的光周期是光照 16h,黑暗 8h ⑶ 湿度:一般情况下,培养器内相对湿度应达 100%,培养室内环境的相对湿度在 70%80% ⑷ 气体:氧气是愈伤组织生长所必需的 ⑸ 渗透压 ⑹ pH 值:培养基的 pH 值大多在5.06.5 ㈡营养成分:①大量元素 ②微量元素 ③碳源 ④维生素类 ⑤肌醇 ⑥氨基酸 ⑦天然复合物 ⑧琼脂 ⑨活性炭 ⑩抗生素 ⑾生长素类 ⑿细胞分裂素类 ⒀赤霉素类和脱落酸 5、培养基的配制、灭菌与保存:㈠培养基的种类◆培养基形态不同:固体培养基、液体培养基◆培养过程不同:初代培养基、继代培养基◆其作用不同:诱导培养基、增殖培养基、生根培养基◆营养水平不同:基本培养基、完全培养基 ㈡几种常见培养基的特点:⑴ MS 培养基:◆无机盐浓度高◆高含量的氮、钾,尤其是硝酸盐◆含有一定数量的铵盐◆营养丰富◆不需要添加更多的有机附加物 ⑵ White 培养基:◆1943 年由 White 为培养番茄根尖而设计◆ 1963 年作了改良,提高 MgSO4 的浓度和增加硼元素◆无机盐浓度较低◆使用广泛◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果⑶ B5 培养基:◆1968 年由 Gamborg 等为培养大豆根细胞而设计 ◆含有较低的铵盐◆较高的硝酸盐和盐酸硫胺素 6、培养基的配制:配制培养基应做好几点工作:⑴实验用具的准备。包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备⑵试剂、药品的准备⑶根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量 7、具体操作如下:⑴取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内,加蒸馏水加热使之溶解,并不断搅拌;⑵根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加▲●…△物,搅拌均匀;⑶加水定容至规定体积,搅拌均匀;⑷调整培养基的 pH 值;⑸分装;⑹封口 8、培养基的灭菌:培养基分装封口后立刻进行灭菌,至少在 24h 内完成灭菌程序。一般采用的是 高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌锅使用时要注意一下几点:①锅中应放足量的水,以免造成空烧或干烧;②装锅时不要过度倾斜,可保持内部有一定的空 间,利于蒸汽流动;③增压前高压锅内的空气必须排净,否则易影响灭菌效果 ④灭菌过程中,应尽量保持压力恒定,严格遵守灭菌时间;⑤排气降压时应缓慢进行;⑥只有待高压锅内压力表指针恢复到零后,才能开启压力锅;⑦高压锅工作时,应有专人看守 9、培养基的保存:灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。检验方法:将培养基置于培养室中 3天,若没有污染现象,说明灭菌可靠,可以使用。◆保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。◆保存时间不可过 第三章 植物组织与细胞培养 1、植物细胞全能性第三章 植物组织与细胞培养 1、植物细胞全能性:植物体的每个活细胞都具有该植物的全套遗传信息,与合子一样,具备发育成完整植株的潜在能力。定义的 3 个方面的含义:①植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞均具有该物种的全套遗传信息②只有在适宜的条件下,植物细胞才具有发育成完整植株的能力③植物每个细胞均具有发育成完整植株的能力。 2 2、◆ 细胞分化:由于细胞的分工而导致细胞结构和功能的改变,或发育方式改变的过程。 3、◆ 细胞脱分化:一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象。即失去已分化细胞的典型特征。 4 4、 ◆细胞再分化:脱分化的分生细胞重新恢复细胞分化能力,沿着正常的发育途径,形成具有特定结构和功能的细胞。细胞再分化的两种途径:①胚胎发生②直接分化器官再形成植株 5 5、高等植物细胞分化、脱分化与再分化过程:胚性细胞(分裂)多细胞团(分化)形态建成(生长)完整植株;成熟细胞(脱分化)分生细胞(分裂)多细胞团(再分化)形态建成(生长)完整植株。 6、胚状体:在植物组织培养中起源于一个非合子细胞,经胚胎发育所形成的胚状结构,又称体细胞胚、不定胚、无性胚。 7 7、 体细胞胚胎发生特点:⑴是离体培养的产物 ⑵起源于非合子细胞 ⑶发育过程与合子胚相似,也经历球形期、心形期、鱼雷期和子叶期阶段 8、在植物组织培养中,诱导体细胞胚胎发生与诱导器官发生相比具有显著的特点:①具双极性②生理隔离③遗传性相对稳定④重演受精卵形态发生的特性 9、体细胞胚胎发生途径: 9、体细胞胚胎发生途径:⑴直接从器官外植体上发生 ⑵愈伤组织发生 ⑶悬浮培养细胞发生 ⑷单倍体细胞发生 ⑸原生质体发生 10、体细胞胚胎起源:▼▼▽●▽●大多数体细胞胚起源于单细胞,体细胞胚发生的实质是细胞分化 11、 体细胞胚胎的生殖隔离:生理隔离是体细胞胚发生的先决条件、生理隔离是相对的 12、 影响植物细胞形态发生的因素:外因是指培养植物细胞的培养基和培养○▲-•■□环境条件。内因是指植物细胞的遗传性和生理状态。①培养基◆生长调节类物质◆营养成分◆渗透压◆pH 值◆固态或液态。②环境条件◆光对细胞形态发生具有诱导反应◆温度有利于器官发生。③器官、组织类型◆不同种植物的器官、组织产生的愈伤组织的器官分化(能力)明显不同,差异显著◆材料的基因型决定④个体发育年龄◆幼嫩部位易诱导形成愈伤组织,也易诱导器官分化◆愈伤组织继代次数越多,器官分化能力愈低。 13、 植物离体无性繁殖的概念:◆简称离体繁殖、微型繁殖或快速无性繁殖◆指利用组织培养方法进行植物离体培养,在短期内获得大量遗传性状一致个体的方法。 意义:①繁殖速度快,经济效益高②占用空间小,不受季节限制,便于工厂化育苗③繁殖各种珍稀、濒危苗木和突变体,为育种服务。 14、 植物离体无性繁殖中的器官五种发生方式:①不定芽型.特点:a、繁殖率高 b、能保持遗传稳定性 c、缩短繁殖周期 ②器官型.特点:a、繁殖率高,但速度慢 b、遗传性稳定 ③器官发生型.特点:a、繁殖速度快 b、遗传性不稳定,易产生变异 c、愈伤组织是遗传转化、细胞培养或原生质体培养的良好材料 ④胚状体发生型.特点:a、数量多、速度快、繁殖系数高;b、遗传性稳定 ⑤原球茎型.特点:指兰属特有的器官发生方式,即外植体经培养产生原球茎,再直接长成植株。 15、 离体无性繁殖的方法:①母株制备②增殖③植株再生④炼苗和移植。 影响因素:1、培养基(选择适宜的培养基、激素及其他添加物)2、培养条件(不同植物离体无性繁殖的最适温度不同,大多为 252℃,一般不低于15℃,不高于 35℃)3、外植体(①外植体材料来源丰富程度②成苗是否容③在培养中的遗传稳定性④试管苗是否整齐一致) 16 16、 快繁中常见的问题:⑴污染:A、来源:①材料表面消毒不彻底②无菌操作中外界环境进入培养容器造成。B、危害:B、危害:①初代培养失败、增殖速度慢、生长速度慢、玻璃化加剧②成活率低、病毒和病菌的扩散、培养物的遗传变异 C、种类:a、细菌性污染①培养基某一位置或培养材料周围出现黏液状物或浑浊的水渍状痕,有时呈发酵状泡沫。接种后 1 ~ 2 天可见。②材料、培养基灭菌不彻底③操作不当 b、真菌性污染①主要是霉菌污染②培养基 污染部位发霉,接种后 3 ~ 5 天或更长时间可见③颜色有黝黑、白、黄等。 原因:①周围环境和空气污染造成②接种过程中,操作不慎造成。 D、防止:①●选择植物材料 :品种、部位、大小、时期②严格消毒灭菌③合理安排繁殖程序④规范操作,控制环境条件。 ⑵褐变:A、原因:◆酚类化合物 ------(多酚氧化酶与氧气) 醌类物质 + 水◆生理状态◆培养基成分◆培养条件不当 B、影响褐变的因素:◆基因型:木本植物比草本植物更易引起褐变◆外植体的生理状态◆培养基◆温度和光照:光能促进植物组织中酚的氧化◆外植体大小:材料太小易褐变◆外植体的受伤程度◆材料转移时间◆灭菌的化学药品 C、克服褐变的措施:◆选择适宜的外植体◆适宜的培养条件◆连续转移◆加抗氧剂C、克服褐变的措施:◆选择适宜的外植体◆适宜的培养条件◆连续转移◆加抗氧剂 ⑶玻璃化现象:◆试管苗的玻璃化◆试管苗的茎、叶变成透明水浸状◆生长畸形◆增殖系数明显下降◆难以诱导生根,其根系质量极差◆移栽成活率极低。 预防的措施: a、使用透气性好的封口材料 b、选择合适的激素种类和浓度 c、采用固体培养基,适当增加琼脂含量,降低水势 d、高温季节时要有降温措施 e、改变供氮形态 f、适当增加培养基中的间苯三酚等抑制玻璃化苗的产生 g、适当延长光照培养时间,提高光照强度 h、适当提高培养基中无机盐含量。 17、试管苗的特点:◆生长细弱◆茎、叶表面角质层不发达◆茎、叶呈绿色◆叶绿体的光合作用较差◆叶片气孔数目少,活性差◆根的吸收功能弱◆对逆境的适应和抵抗能力差。 提高试管苗移栽成活率的措施:◆提高试管苗生根质量◆加强移栽前炼苗◆保证组培苗移栽基质质量◆作好移栽前根系处理◆湿度控制◆温度控制◆光照控制。 18、愈伤组织培养概念:是指将母株上的各个部分切下形成外植体接种到无菌培养基上,进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。 19、愈伤组织细胞的分化大致经历三个时期,即: 19、愈伤组织细胞的分化大致经历三个时期,即:诱◆▼导期、分裂期和分化期。 20、愈伤组织的形态发生:⑴不定芽和根的发生: 20、愈伤组织的形态发生:⑴不定芽和根的发生:是愈伤组织培养物或细胞培养物培养中常见的器官发生方式,分 三个不同生长阶段:A、细胞和离体外植体脱分化形成愈伤组织 B、愈伤组织中形成一些分生,形成瘤状结构 C、器官原基的形成。 ⑵体细胞胚的发生的三个特征:a、具有两极性 b、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系,而不定芽或不定根往往与愈伤组织的维管组织相联系 c、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形,而不定芽的维管组织无此现象 21、愈伤组织的器官发生顺序:a、无芽的根或无根的芽 b、先芽后根 c、先根后芽 d、同时长根和芽 22、愈伤组织的遗传变异:⑴引起异质性的原因:A、外植体染色体倍数性与遗传组成不同的细胞经诱导后的分裂。B、培养条件引起的不规则性。 ⑵初生愈伤组织,接种到培养基上后,细胞核内的变化:A、正常有丝分裂 B、先核内复制,后有丝分裂 C、先核碎裂,后有丝分裂 23、愈伤组织的影响因素:A、培养基(生长调节物、无机营养元素、有机成分、物理性质)B、组织原有的倍数性 C、培养环境的条件(光照、温度) 24、愈伤组织培养的应用: 24、愈伤组织培养的应用:a、加快园艺植物新品种和良种繁育速度 b、培养无病毒苗木 c、获得倍性不同的植物d、克服远缘杂交困难 e、利于种质资源长期保存和远距离运输 f、提供育种中间材料 g、诱发和离体筛选突变体h、制造人工种子。 25、器官培养:是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 26、根的培养:将表面消毒后的植物种子在无菌条件下萌发,待根伸长后从根尖切取长 1.0cm 的根尖,接种于培养基中,待侧根生长约一周后,即可取侧根的根尖进行扩大培养。 28、影响离体根生长的因素:基因型、培养条件、激素、pH、光照和◁☆●•○△温度等。 29、茎尖▲=○▼的培养概念与意义:◆据培养目的与取材大小◆茎尖分生组织培养:长度小于 0.1mm,常带有 1~2 个叶原基◆普通茎尖培养:茎尖、芽尖、侧芽◆用于植物开花生理的研究◆无毒苗木的生产 : 31、培养方法:(1)材料制备(2)培养基(3)培养方式。 A、固体培养:茎尖紧贴培养基、25~28℃恒温、100%相对湿度 B、纸桥培养:◆滤纸代替琼脂◆液体培养基◆工艺复◆康乃馨茎尖培养 32、影响因素:◆基因型◆外植体大小•●◆供试植株的生理状态及年龄◆芽的着生部位◆培养基◆褐变◆玻璃化◆遗传稳定性。 33、叶的培养:离体叶培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。 : 34、叶培养的意义:(1)研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成(2)证实叶细胞的全能性(3)探索离体叶培养的条件与影响因素,提供理论依据(4)建立快速无性繁殖系,提高繁殖系数(5)诱★△◁◁▽▼变处理,筛选突变体,应用于育种实践。 35、叶原基培养: 35、叶原基培养:◆采用休眠的顶芽,剥去部位鳞片◆在 5%NaClO 液中浸泡 20min 左右,表面消毒◆切取柱状叶原基进行培养◆培养基:Knops 无机盐或 Kundson,填加 Nistch 中的微量元素、CoCl2、2%蔗糖、8%琼脂,pH5.5◆温度 24℃、光照 24h。 : 36、叶组织的分化与再分化:(1)叶组织分离与消毒(2)培养基(3)培养条件◆25~28℃◆光照 12~14h◆光强度为 1500~2000lx。 37、影响因素:◆基因型◆细胞分裂素与生长素的配合◆供试植株的发育时间与年龄◆叶脉◆极性◆损伤 : 38、离体叶组织的茎与芽发生途径:(1)直接产生不定芽(2)由愈伤组织产生不定芽(3)胚状体形成△▪▲□△(4)其他途径:小鳞茎、原球茎等。 39、植物细胞培养:①机械法:利用▪▲□◁叶肉组织或愈伤组织排列疏松、细胞间接触较少的特点,将叶片轻轻研碎,经过滤和离心,收集和净化细胞。 优点:a、细胞未受酶伤害 b、有利于细胞的生理和生化研究 c、无须质壁分离。②酶法:。②酶法:利用果胶酶、纤维素酶来处理植物叶片或其他外植体,使细胞分离。 ③化学法:利用一些化学药剂游离细胞。如秋水仙碱等。 特点:①分离细胞数量大②易引起细胞改变。 40、培养方法与影响因素:1、细胞悬浮培养:是将植物游离细胞或细小的细胞团,在液体培养基中进行培养的方法。 为两种类型:①成批培养②连续培养。 特点:a、生长速度快,适于大规模培养及工业化生产有用的细胞次生代谢物; b、能大量提供分散性好且较为均匀的细胞,用于细胞基础研究、突变体筛选或作为遗传转化受体等;c、大规模悬浮培养成本较高。 (2)连续培养:是用一定容积但非密闭的特别容器进行大规模细胞培养的一种方法。 特点: 特点:a、使细胞保持在增殖最快的,对数生长期 b、具有稳定的培养状态 c、适于大规模工业化生产(开放式,密闭式)。 41、细胞生长曲线:延迟期、对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期。 42、单细胞培养程序:建立细胞株------高产细胞株的选择------ 分化培养或扩大培养------鉴定和提取。 43、①建立细胞株:A、确定材料 43、①建立细胞株:A、确定材料◆选择易于分散的花粉为材料◆分散性好的愈伤组织材料◆直接从叶肉、根尖、髓组织取材 B、悬浮细胞液的制备◆振荡培养分散性好的材料,提取◆用孔径为 200~300 目的网过滤收集 ②起始浓度控制: ②起始浓度控制:◆细胞密度◆起始细胞密度:临界密度 ③高产细胞株的选择◆细胞株:在培养基上生长出的每个细胞团都来自一个细胞的分裂。◆初步鉴定和测定◆高抗、高品质、高产④分化培养与扩大培养⑤鉴定与提取。 第四章植物脱毒技术 茎尖分生组织培养 1、为什么要培育脱毒苗?④分化培养与扩大培养⑤鉴定与提取。 第四章植物脱毒技术 茎尖分生组织培养 1、为什么要培育脱毒苗?由病毒引起植物产量和品质退化的事例甚多。多数植物都受到一种或几种病毒侵染,且带毒株比率高。病毒对寄主植物造成毁灭性危害,导致大幅度减产,甚至全株死亡。潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害,不易被发现,尤其危险。受病毒侵染的植物全身终身带毒,目前尚无有效药物可以治愈。利用植物茎尖等方法脱毒,培育无病毒苗,是解决病毒危害的有效途径。 2、什么叫无病毒苗?是指不含该种植物的主要危害病毒,即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。 3、为什么茎尖培养能够除去病毒?一是病毒运转速度慢。二是茎尖分生组织没有维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞分裂和生长的速度,所以生长点的病毒数量极少,几乎测不出来。 4 4、提高脱毒效果:①高温处理②低温处理③化学处理 5 5、 其他途径脱毒:a.愈伤组织脱毒 b. 珠心胚培养脱毒 c.微尖嫁接脱毒. 6、脱毒苗鉴定: 只有经检测后被鉴定为无病毒的苗,才能确认为脱毒苗,方可用于扩大繁殖。方法:a.植物病毒症状检测(目测法)---随时观察植株茎、叶、芽是否出现该种病毒所特有的可见症状 b.指示植物检测法--- 指利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类标准的方法。c. 血清学检测法--把提纯的病毒(抗原)注射到动物体内(家兔等),则在体液特别是血液中产生抗体 d.电子显微镜检测法----可观察到有无病毒及病毒颗粒大小、形状和结构。e.分子生物学鉴定法. 7 7、无病毒苗的保存和繁殖---无病毒苗的保存:A.隔离保存 B.长期保 a.低温保存 b.冷冻保存。无病毒苗的繁殖:A.无病毒苗的繁殖方法①嫁接繁殖②扦插繁殖③压条繁殖④匍匐茎繁殖⑤微型块茎繁殖。B.无病毒苗繁殖生产体系 第五章 原生质体培养与体细胞杂交 1、原生质体的概念:指植物细胞除去细胞壁以外的部分。 2、原生质体的用途: 2、原生质体的用途:①体细胞杂交②由于原生质体没有细胞壁,所以不同的原生质体可以相互靠近,发生融合,进行细胞杂交。2 个不同植物体细胞发生融合、形成★▽…◇新细胞的过程,称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞,再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。 3、原生质体的分离方法:①机械法:通过对植物组织进行切割、研磨等方法破坏植物细胞壁,使原生质体游离出来的一种方法。 缺点:效率极低、原生质体破碎严重,完好的原生质体数量少。 优点:对◆■原生质体以后的负面影响小。②酶解法:利用一些酶分解植物细胞壁而获得原生质体的方法。 优点:分离原生质体的效率很高,用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体,已成为分离原生质体的最主要方法。 4 4、 原生质体培养:发育过程:原生质体在培养过程中,首先形成细胞壁(原生质体由圆形变为一定形状),后来进行分裂、形成细胞团、愈伤组织、完整植株。 5。 5、 体细胞杂交:2 个不同体细胞发生融合的过程,称为体细胞杂交。 6 6、 体细胞杂交概念:即原生质体融合,使分离下来的不同亲本的原生质体,在人工控制条件下,像性细胞受精作用那样相互融合成一体。 7、原生质体融合的意义:◆使植物无性杂交成为可能◆使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实◆打破了物种间的界限 8、原生质体融合的类型:⑴自发融合⑵诱发融合 9、融合时可能出现的融合形式 9、融合时可能出现的融合形式:A、异核体或异核细胞(细胞质融合,细胞核没有融合)B、杂种原生质体或合子细胞(双核异核体的细胞核融合产生的)C、同核体(相同原生质体融合产生)D、非对称杂种或细胞质杂种 10、诱发融合的主要方式有:⑴化学融合方法:采用化学融合剂,促使原生质体相互靠近、粘连融合。常用的化学融合剂主要有 PEG、NaNO3 等。⑵物理融合方法 11、 原生质体融合过程:⑴原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集,彼此靠近;⑵两个相邻原生质体之间的质膜相互融合,随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布;⑶细胞质发生融合;⑷细胞核发生融合,形成单核融合细胞。 12、影响原生质体融合的因素:A、原生质体质量 对细胞的融合起着至关重要的作用,高质量的原生质体是细胞融合的首要条件 B、融合方法 C、融合参数 各种融合液都应选择适当 13、 互补选择:利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 14、互补选择方法:A、白化互补选择法 B、营养缺陷型互补选择 C、抗性互补选择 D、代谢互补抑制选择 15、机械选择法:利用融合细胞所具有的可见标记,在倒置显微镜下,用微管将融合细胞吸取出来进行选择的方法。

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