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组培瓶

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组织培养_百度文库

发布时间:2019-09-19 23:44 浏览次数:

  组织培养_医学_高等教育_教育专区。第一章 实验室及基本操作 第一节 实验室及基本设备 一、实验室(准备室、预备室、无菌操作室、培养室、温室) 1.准备室 2.预备室 4.培养室 功能:器具清洗保存,培养基配制与灭菌,蒸馏水生产,常规生

  第一章 实验室及基本操作 第一节 实验室及基本设备 一、实验室(准备室、预备室、无菌操作室、培养室、温室) 1.准备室 2.预备室 4.培养室 功能:器具清洗保存,培养基配制与灭菌,蒸馏水生产,常规生理生化分析等。 功能:净化空气,换工作服,防止将杂菌带入无菌操作室。设备:衣架、鞋架、紫外灯、空气净化系统 功能:植物材料的消毒、 接种、培养物的继代 主要仪器设备:超净工作台:器械车、空调机、紫外灯、器械灭菌器 功能:接种后的材料培养 设备仪器:培养架、空调系统、净化系统、定时器、生物培养箱、摇床 准备室的常用仪器设备:天平、电冰箱、水浴锅、高压灭菌器、离子交换纯水器、干燥箱、酸度计、微波炉、电磁炉或电炉、药品柜 3.无菌操作室 5.温室:功能:组培苗的炼苗;设备:培养架、育苗盘、苗床、温湿度计、灌水系统、加温降温保温设备等 二、基本设备 (一)器皿和器械 1.玻璃器皿:培养器皿(试管、三角瓶等);分注器 (注射器式分注器、 量筒);其他玻璃器皿 (烧杯 量筒 移液管 移夜枪 容量瓶等) 2.器械类:镊子类、解剖刀、剪刀类、接种针、细菌过滤器 (二)仪器设备 1.无菌操作设备: (1)高压蒸汽灭菌锅:大型卧式、中型立式和小型手提式等;小型手提式有内热式和外热式;电热式、锅炉蒸汽式; (2)超净工作台:垂直风、水平风;双人、单人;双面式、单面式; (3)培养设备:摇床和旋转床、人工气候箱、光照培养箱、空调、加湿器和去湿机、定时器、培养架(规格) ; (4)药品贮存和配制仪器设备: 电热磁力搅拌器、冰箱、酸度计; (5)天平类型及使用方向:称量精密度为 0.1g,用来称取蔗糖和琼脂等;精度为 0.001g 称量大量元素;精度为 0.0001g,用来称取微量元 素和植物激素及微量附加物;机械天平与电子天平; (6)观察分析仪器设备:体视显微镜、光学显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜; (7)其他仪器设备:无离子水制备设备、离子交换纯水器(系统) 、超声波清洗机、离心机、器械车、电热器械灭菌器、培养基制作生产线、 双头自动定量灌装机、组培专用洗瓶机 组织培养室的设计 第二节 基本操作▷•● 一、洗涤 各种用具、器皿必须清洗干净。 玻璃器皿清洗方法: 1.新购置的玻璃器皿:1%HCl 浸泡数小时→自来水冲→中性洗涤剂洗→自来水冲洗(不挂水珠)→无离子水冲淋 2——3 遍→空(烘)干备 用(注意防尘) ; 2.用过的玻璃器皿:自来水泡→去残物→中性洗涤剂洗→自来水冲不挂水珠→无离子水冲 2——3 遍→空干备用; 3.不宜刷洗的如吸管、滴管、或特别脏的玻璃器皿:▼▲洗涤剂(去污粉等)浸泡→自来水→晾干→洗液浸泡若干小时→自来水冲净→蒸馏水 1——3 遍→晾干; 金属器械,新购置的需先擦净上面的油腻,然后用热肥皂水洗净、擦干; 饱和重铬酸钾洗液:43g 重铬酸钾溶于 1000ml 蒸馏水制成饱和溶液,缓慢加入浓硫酸,体积比 1:1; 超声波洗净法:物理法,无污染,效果好。但容量有限。 二、灭菌 (一)器具的灭菌 1.干热灭菌法:铝箔包裹,150℃恒温干燥箱,2h. 2.高压蒸汽灭菌法:玻璃、金属器械(密封或用纸张包裹) ,121℃ 下保持 15-20 分钟,自动降温到 50℃ 以下取出,备用。 (二)培养基的灭菌 1.高压蒸汽灭菌法:灭菌时间与需要灭菌的培养基量密切相关。 培养基高压蒸汽灭菌过程:高压锅注水——通电加热——装锅(分装好的培养基)——排出冷空气——关闭放汽阀,升温升压——121 度, 15-20 分钟——断电,降温降压——开锅,取出培养基,冷却——灭菌好的培养基——接种、培养。 使用高压灭菌锅时注意事项: 通电前,检查水位,添加蒸馏水; 锅内气压过高(超过 1.52× 105 Pa)会引起部分有机物质的分解; 灭菌后在气压表归零之前不要打开锅盖,以免发生危险和培养基外溅现象; 橡胶等有机物品会因高温而变形,高温变性的有机药物不能使用高压锅灭菌; 防止高压锅的排气气孔堵塞,以免发生爆炸。 原则:房间安排合理,工作便利,污染少,节省能源,使用安全 2.过滤除菌法:用于热不稳定物质,如吲哚乙酸,维他命 C 等 三、无菌操作 无菌操作室要定期熏蒸灭菌,室内消毒的方法有: (1)甲醛熏蒸,2ml/m3;(2)石碳酸(酚)3-5%喷雾;(3)硫磺 15g/m3;(4)来苏尔(煤酚皂)1-2%喷雾; 室内保持清洁卫生; 每次使用之前,用紫外线%酒精喷雾使空气的灰尘沉降,用 75%酒精擦洗工作台面; 更换工作服(衣服、帽子、口罩等) , 保持清洁; 接种前工作人员要用肥皂洗手,用 75%酒精擦洗手; 接种使用的器械、器皿等用具,必须经过高温灭菌(电热灭菌器、酒精灯等) 。 第三节 培养基 一、培养基的构成 分为两种:固体培养基、液体培养基。 主要构成因素:水分、无机盐类、有机营养成分、植物生长调节物质、天然有机添加物质、pH、凝固剂等。 (一)水分生理功能质量要求 (二)无机盐类 1.大量元素 一般指浓度﹥0.5mmol/L。 氮(N) :利用的形态,以氮硝态氮为主(如 KNO3 等) ,铵态氮(如(NH4)2SO4 等) ,通常铵>8.0mmol/L 对培养物就有毒害作用; 磷(P) :磷酸盐(如 KH2PO4) 钾(K) :K+◁☆●•○△ ,K(NO3) 钙(Ca) 、镁(Mg) 、硫(S) , 1~3mmol/L 比较合适。 CaCl2,Ca(NO3)2,MgSO4 钠、氯 2.微量元素:浓度<0.5mmol/L,一般 10-4~10-2mmol/L。 铁(Fe)Fe2(SO4)3、 FeC13,和乙二胺四乙酸二钠(Na-EDTA)结合成鳌合铁; 铜(Cu)CuSO4; 钴(Co)CoCl2; (三)有机营养成分 1.糖类物质:碳源与能源;调节培养基渗透压;蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖等;蔗糖用量范围 10~50g/L(渗透压范围 152~415kPa), 2.维生素类:常用浓度为 0.1~10mg/L:抗坏血酸(维生素 C) 、盐酸硫胺素(维生素 B1) 、盐酸吡哆素(维生素 B6) 、烟酸(维生素 B3) 、 泛酸钙(维生素 B5) 、生物素(维生素 H) 、叶酸、肌醇(环已六醇) ,50~100mg/L 3.氨基酸类: 重要的有机氮源: 甘氨酸 水解乳蛋白(LH)通常用量同上。 (四)植物生长调节物质 1.生长素:使用浓度 10-7~10-5mol/L 有:吲哚乙酸(IAA) 、萘乙酸(NAA) 、吲哚丁酸(IBA) 、2,4—二氯苯氧乙酸(2,4-D) 。 功能:愈伤组织形成,生根,不定胚形成,对芽的抑制作用 生理作用的强弱顺序为 2,4-D>萘乙酸>吲哚丁酸>吲哚乙酸。 2.细胞分裂素:激动素(呋喃氨基嘌呤,糠基嘌呤, K•☆■▲T) 、6-苄基腺嘌呤(6-BA ,或 BA) 、玉米素(ZT) 、2-异戊烯腺瞟吟(2ip) 、噻重氮 苯基脲(TDZ) ;氯吡苯脲(CPPU) 作用的强弱顺序大致为 CPPU,TDZ > ZT >2ip > 6-BA> KT; 它们经高温高压灭菌后性能仍稳定。但激动素受光易分解,故应在 4℃-5℃低温黑暗下保存。 3.赤霉素(GA):经常使用 GA3 (五)天然有机添加物质 1.椰乳(CM) :椰子的液体胚乳。用量 100~150mg/L; 2.香蕉泥:用量 100~200g/L; 3.马铃薯:去皮和芽,煮 30min,过滤,加入培养基。用量 150~200g/L; 4.酵母提取液(YE):用量约 0.01% ~0.5 %; 5.麦芽提取液:用量为 0.01%~0.5%; 6.苹果汁、蕃茄汁、柑桔汁等。 5%-10% 具较大的 pH 缓冲作用。促进组培苗的生长、分化。 (六)pH:一般调整到 5.0-6.0 之间; 测定方法:pH 仪,精密 pH 试纸 调整方法:用 1mol/L 或 0.1mol/L 的 NaOH,或 HCl 调整 4.脱落酸(ABA) 常用量 2mg/L-3mg/L、 丝氨酸、 谷氨酰胺、 酪氨酸、 天冬酰胺、 水解酪蛋白 (CH) 常用量 300~2000mg/L、 锌(Zn)Zn SO4; 钼(Mo) Na2MoO4; 锰(Mn)MnSO4; 碘(I) KI 硼(B)H3BO3; (七)凝固剂 1.琼脂:条剂或粉剂,常用量 7~10g/L;影响琼脂凝固的因素:用量少或纯度不高,pH 偏低或偏高, 灭菌时间过长,灭菌温度过高 2.卡拉胶(又称角叉聚糖) ; 3.结冷胶:结冷胶一般用量通常只为琼脂用量的 1/2~1/3,0.5g/L 即可形成凝胶(通常用量为 2~25g/L) 。透明性好于琼脂。 4.琼脂糖 (八)其他添加物:活性炭、维生素 C、硝酸银、抗生素:青霉素、链霉素、卡那霉素等,用量一般为 5-20mg/L 二、培养基的选择 (一)培养基的基本类型 1.高盐成分培养基:MS 特点:无机盐浓度高,尤其硝酸盐、钾离子、铵离子等含量丰富,元素平衡较好,缓冲性能好,微量 元素和有机 营养成分齐全丰富,应用最广泛。其它:LS(1965)、BL(1968)、ER (1965)等培养基。 2.硝酸钾含量较高的培养基:硝酸钾等盐浓度高,但铵态氮低,包括 B5 (1968) 、N6(朱至清,1975)、SH(1972)等。 3.中等无机盐含量的培养基: 大量元素为 MS ?,微量元素种类少而含量高。 4.低无机盐培养基: 无机盐为 MS 1/4 左右。 依据:植物种类,材料的类型,培养目的。通过实验来确定。 (二)基本培养基的选择 1.MS 培养基适宜:生长速度快,对无机营养元素要求多的植物,如蔷薇科等。对铵盐高易引起毒害的植物不适宜; 2.B5:豆科植物,木本植物。铵盐较低; 3.N6:禾本科如水稻、小麦,以及其他植物的花粉、花药培养; 4.改良 White 培养基(1963):生根和幼胚培养; 5.WPM 培养基:木本植物培养,氮含量较低 三、培养基的配制 (一)培养基母液的配制 两种方法:单一化合物母液 ;混合母液 基本培养基母液(大量元素、微量元素、有机营养成分、铁盐、钙盐) 生长调节剂母液:制备母液时应该注意几点:药品纯度;配制溶剂;称量准确;药品交叉;存放条件;存放时间; (二)培养基配制 1.贮藏母液按顺序排好,准备好所需的各种用具和器皿; 2.烧杯(或不锈钢锅)中注入培养基量的 1/3 左右无离子水,加入琼脂和蔗糖溶解; 3.顺序加入母液;用剩余体积的水定容; 4.调整 pH 值; 5.分装,封口; 6.灭菌; 7.冷却备用 第四节 离体培养体系的建立 一、供体植物材料:田间材料、温室材料、无菌发芽材料(培养室内无菌发芽) 二、外植体的选择和处理 (一)选择原则:再生能力强 (三)外植体材料灭菌 1.常用的灭菌药剂 三、培养条件 温度:依据植物种类习性,25± 2℃; 光照:强度 1000~6000Lx(常用 3000Lx 左右);时间长度 16h/d;光质;光周期; 湿度:培养瓶内培养初期接近 100%;室内常年保持 70%~80%为宜; 培养基营养物质浓度和 pH 变化; 培养物的气体环境。 第二章 植物组织培养的原理 第一节 植物细胞的全能性和细胞分化 一、 植物细胞全能性: 是指每一个植物细胞带有该植物的全部遗传信息,在适当条件下可以表达出该细胞的所有遗传信息,分化出植物有机体 所有不同类型的细胞,形成不同类型的器官甚至胚状体,直至形成完整再生植株. 离体细胞脱离了原来供体的束缚,其生命特征属性的表现过程和形式都发生了变化。如:光合作用能力,胚胎发生,细胞变异等 二、植物细胞分化 1.细胞分化是指导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。 2.细胞分化是组织分化和器官分化的基础,是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础. 2.植物材料灭菌的一般过程:材料前处理、灭菌剂和器具(器皿)准备、材料灭菌 3.污染源及其表面特征 ;遗传稳定性好;外植体来源丰富;外植体灭菌容易。 (二)常用的外植体:茎尖、节间部、叶和叶柄、鳞片、种子、根、块茎、块根、花托、花药、花粉等 3.基因的活化或阻遏使细胞在结构、生理生化特性上发生改变,导致细胞分化。 一个成熟的、已经分化的细胞仅有 5%-10%基因处于活化状态。 组织培养技术揭示的主要规律和机理: 1.生理生化分化在先,形态结构分化在后; 2.发育中的植物不存在部分基因永久关闭; 3.在完整植株上,细胞发育途径一旦被“决定”不易被改变,但离体培养可以改变; 4.极性与分化关系密切; 5.植物生长调节剂在细胞分化中具有明显的调节作用 第二节 离体条件下植物器官的发生 一、 脱分化: 也称去分化,是指离体培养条件下生长的细胞、 组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态, 形成无组织结构的细胞团或愈伤组织,或成为未分化细胞的过程. 脱分化是分化的逆过程 自然界存在的脱分化现象;叶片的离层形成(秋季落叶) ;根或茎中的薄壁细胞形成根原基(不定根形成) ;伤口的愈合等 影响细胞脱分化的因素:损伤、生长调节剂、光照、细胞位置、外植体的生理状态、植物种类差异 二、再分化:离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化,形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官,甚至形成完整的 植株,这个过程称为再分化. 植物再分化的不同阶段: 1.细胞水平的再分化;2.组织水平的再分化;3.器官水平的再分化;4.植株再生:先芽后根;先根后芽;芽根同时形成; 影响细胞再分化的因素:1.不同植物种类再分化的能力差异很大.2.对某些植物的植株再生条件还没有完全掌握. 三、愈伤组织培养与植株再生 1.愈伤组织的形成过程: (1)诱导期(启动期) :1 至数天,生理生化变化; (2)分裂期:外围细胞分裂,细胞数量迅速增加,细胞体积变小,分裂快,疏松,无组织结构,颜色浅而透明; (3)分化期:生理变化-形态与功能各异的细胞 愈伤组织的生长:分裂快,细胞数量迅速增加,细胞体积变小;理生化变化:RNA 含量迅速增加;继代培养中次生物质积累水平和能力变 化;对生长素的依赖性降低(出现驯化现象) ; 质地:致密型和松软型 2.愈伤组织的形态发生 (1)体细胞胚胎发生;(2)器官发生:先形成芽,后在芽基部长根;先形成根,再从根基部形成芽;在愈伤组织不同部位分别形成芽和根,然 后根和芽的维管束接通形成完整植株;仅形成芽或根。 第三节 植物体细胞胚胎发生 合子胚:经过受精后,合子发育成的成熟胚;胚状体:植物离体培养的细胞、组织、器官经历一个类似胚胎的发生发育过程所产生的胚。 一、植物体细胞胚胎发生过程:植物离体培养细胞产生胚状体的过程称为体细胞胚胎发生. 1.体细胞胚胎发生过程 胚性愈伤组织诱导——体细胞胚胎诱导——体细胞胚胎早期分化发育——体细胞胚胎成熟——体细胞胚胎萌发和成苗。 2.胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态差异 胚性和非胚性细胞或愈伤组织相比:DNA、RNA 以及蛋白质的合成更为活跃,表现为含量和种类的增加、淀粉和可容性糖含量增加、内源 多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等. 3.体细胞胚胎发生的基因表达机理 二、 植物体细胞胚胎发生途径 1.直接途径:从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎; 2.间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织,再从愈伤组织的某些细胞分化出体细胞胚胎. 三、植物体细胞胚胎发生的两个显著特点: 1.双极性:一端是芽、一端是根; 2.生理隔离:与外植体的微管束系统无直接联系。生理隔离是体细胞胚发生的先决条件。 四、植物体细胞胚胎发生的生理学和生物化学机理不十分清楚。 1.蛋白质和核酸:在胚性细胞(愈伤组织)中蛋白质、DNA、RNA 含量更丰▲●…△富; 2.糖类、金属离子和微量元素:蔗糖 体细胞胚发生; 3.多胺代谢:参与 DNA、RNA 、蛋白质合成的调节,在转录和翻译水平上对基因进行调控; 4.内源激素:生长素:启动细胞分裂和胚性潜力的诱导,促进体胚的早期发育。 细胞分裂素:高水平的细胞分裂素可能对细胞的分裂和生长很重要,但它并不直接参与胚的发生。 碳源、维持渗透压,3%-6%;淀粉合成量增加;金属离子 Ag+ 、Co 2+ 、Ni 2+、稀土元素有利于 第四节 影响植物离体形态发生的因素 外植体的基因型和生理状态、培养基、培养条件等是影响离体形态发生的主要因素。 一、植物种类和基因型 胚胎发生能力:甜橙>宽皮橘>柚 二、培养材料的生理状态 (一)植株的发育年龄:植物个体发育:幼态期、成熟期和衰老期。 一般幼态期更容易具有较高的形态发生能力。如杜鹃茎段生根; (二)培养器官或组织类型:双子叶植物形态发生常用:叶、茎、胚轴、子叶○▲-•■□等;单子叶植物特别是禾本科常用:叶基部、茎尖、幼胚、 胚珠、幼花序轴;裸子植物常用:子叶 (三)培养时间:无菌苗的培养时间、继代培养次数对生根影响 三、培养基 (一)植物营养:提高无机磷含量可促进器官发生;降低盐、糖浓度促进根发生;MS 培养基有利于芽诱导等 (二) 植物生长调节剂:是影响植物离体形态发生的最关键因素 1.生长素:促进生长、生根,并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化与侧芽萌发生长。2,4-D 用于体细胞胚胎发生;IAA、IBA、NAA 等用□◁ 于生根、生长等; 2.细胞分裂素:促进分化和芽形成,抑制根发育与衰老; 3.赤霉素:促进茎的伸长、打破休眠,对芽的诱导和形成有促进作用。 (三)物理性质:培养基的物理性质:固态、液态、渗透压等 四、培养条件 (一)光:1.光照强度:对增殖、器官分化、胚状体形成都有重大影响。龙眼体胚发生需要黑暗,卡里佐枳橙新梢分化需要强光。 2.光照长度:短日照敏感的葡萄品种茎段仅在短日照条件下培养才形成根。3.光质:红光促进菊芋块茎组织形成根; (二)温度: 最适宜温度:文竹 17 ℃ ,百合 20 ℃ ,杜鹃 25 ℃ ,葡萄 28 ℃; 低温:唐菖蒲试管鳞茎移出试管前需要低温处理 2 ℃下维持 4-6 周。 第三章 植物器官和组织培养 植物器官培养:是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。包括根、茎、叶、花器、果实和种子在内的营养器官 和繁殖器官。 第一节 植物器官和组织培养的基本程序:无菌外植体的获得——初代培养物建立——形态发生——植株再生 一、无菌外植体的获得 (一)茎尖、茎段、叶片的灭菌 方法一: (中性洗涤液浸数分钟) ——清水冲洗外植体—— (超净工作台上) 0.1%~0.2%氯化汞溶液浸泡 2~10min (或加入数滴土温-20) —— 倒掉灭菌液——无菌水冲洗 3~5 次,每次 3~5min 方法二:外植体——(超净工作台上)70%乙醇浸泡数秒钟——10%次氯酸钙溶液浸泡 10~20min——倒掉灭菌液——无菌水冲洗 3~5 次, 每次 3~5min——置于无菌纸上——适当分割后接种 (二)根、块茎、鳞茎的灭菌:杂菌多,去除难。软刷清洗,增加灭菌时间、或增大灭菌剂浓度、或用 2 种以上灭菌剂 (三)花蕾的灭菌:未开放花蕾中的花药处于无菌状态,容易灭菌。乙醇和其它灭菌剂结合使用。 (四)果实、种子的灭菌:乙醇和其它灭菌剂结合使用 二、初代培养物的建立 确保培养物无污染需要注意: 1.无菌环境:培养基、接种器械、超净工作台、室内清洁; 2.规范操作:熟练的技术、丰富的经验、严格的规程; 三、形态发生和植株再生 四、培养产物的观察记载 (一)愈伤组织 外观描述:颜色:绿色、淡绿色、黄色、紫色等;紧密度:致密型、松散型 统计项目 愈伤组织诱导率、愈伤组织生长量 愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的外植体数/外植体总数*100% 愈伤组织生长量=培养一定时间后愈伤组织干重或鲜重-接种时愈伤组织干重或鲜重 (二)胚状体 统计项目 胚状体诱导率、平均胚状体数 胚状体诱导率=产生胚状体的外植体数/外植体总数*100% 3.条件合适。 遗传上或亲缘上越近的材料,要求的条件相似。 (三)芽:由顶芽或腋芽萌发产生丛生芽;经愈伤组织产生不定芽 统计项目 (四)根 统计项目 发根率、平均发根数 发根率=发根芽数/培养芽数× 100% 第二节 植物营养器官培养 一、植物根段培养:即以植物的根切段为外植体进行离体培养的技术。 用途:药物生产(人参) ,根的生理代谢、器官分化、形态建成基础研究。 (一)根无性系的建立 根的直接增殖:番茄根,10mm/d, 并能无限生长 根的间接增殖:由根段诱导愈伤组织,后再生芽和根 (二)影响离体根发生和生长的因素 基本培养基 生长调节剂 植物材料 培养方式 光照和温度 pH 例如 毛白杨不定根培养,0.0~0.1mg/LNAA,7d 后根平均长 58.3mm,5.0mg/LNAA 时根停止生长。 苹果愈伤组织在黑暗下培养生根,毛白杨则对光不敏感。 二、植物茎段培养:即以植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体(包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段)进行离体培养的技术. 用途:快速繁殖,茎细胞分裂潜能、变异诱导与筛选等研究。广泛用于蕨类、草本植物、木本植物 接种茎段经过培养可获得:单芽(苗) ,丛生芽(苗) ,愈伤组织,完整植株 三、植物叶片培养:即以植物的叶器官为外植体进行离体培养的技术。包括:叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、叶肉、子叶。 用途:研究叶形态发生、光合作用、叶绿素形成、遗传转化等 通过叶片培养可获得:不定芽或胚状体、愈伤组织、成熟叶(由叶原基发育成) 第三节 植物繁殖器官培养 一、植物花器官培养:即对植物整朵花或花的组成部分(包括花托、花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等)进行离体培养的技术. 用途:花性别决定、种子与果实发育、花的形态发生等研究 花托、花柄、花瓣、花蕾等培养可获得:成熟果实(人参、番茄、葡萄的花蕾培养) ;不定芽;愈伤组织。 二、植物幼果培养:即对植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养的技术. 用途:果实发育、种子形成和发育等研究 幼果培养可能获得:成熟果实;愈伤组织。 如草莓、葡萄、越橘幼果培养 三、植物种子培养:即对受精后发育不全的未成熟种子和发育完全的成熟种子进行离体培养的技术. 用途:打破种子休眠,缩短生活周期;挽救远缘杂种,提高杂种萌发率; 培养成熟或未成熟种子可获得:小植株;愈伤组织;丛生芽或不定芽; 对培养基的要求:应根据培养目的(幼苗、愈伤组织) 、种子发育的不同★-●=•▽时期而调整。 第四节 植物组织培养 一、植物分生组织培养:即对植物的分生组织(包括植物根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织)进行离体培养的技术. 其中茎尖培养研究最为深入,广泛用于植株再生和脱病毒研究。 切取茎尖方法:灭菌,显微镜下鳞片剥离与茎尖切取; 茎尖大小:脱毒苗,<1mm;快速繁殖,1-5mm 可能获得培养产物:单(丛生)芽;胚状体;愈伤组织 二、植物愈伤组织培养:即诱导植物外植体产生愈伤组织并对其培养的技术. 用途:研究植物脱分化与再分化、生长与发育、遗传变异、育种、次生代谢产物生产等;愈伤组织是悬浮培养细胞和原生质体的来源。 特点:有质地差异;颜色差异;组成差异 同质细胞组成的外植体(如贮藏薄壁细胞、次生韧皮部薄壁细胞)诱导产生出的愈伤组织,其发育高度一致; 异质细胞组成的外植体(如根、茎、叶等)诱导产生出的愈伤组织也是异质的,即愈伤组织由不同类型细胞分裂而来。 黑暗或弱光,25℃。生长快,继代周期短。 三、植物薄层组织培养:即对植物的薄层组织进行离体培养的技术. 用途:研究离体组织形态发生机理和影响因素、遗传变异产生机理等 操作:灭菌后器官,切取薄细胞层(3-6 层细胞) ,在一定条件下培养。 第四章 植物胚胎培养及离体授粉 第一节 植物胚培养 一、胚培养的类型 芽分化率、平均分化芽数 芽分化率=产生芽的外植体数/外植体总数*100% 1.成熟胚培养:打破休眠,简单培养基(大量元素和蔗糖) ,适宜生长的培养条件。 2.幼胚培养:尚未成熟的、发育早期的胚培养。难度大。 幼胚培养生长方式( 2 种) : a.继续进行正常的胚胎发育(理想的方式) ;b.迅速萌发为幼苗(早熟萌发) ,苗瘦弱,易早亡。 案例:荠菜、大麦、曼陀罗属、柑橘属、菜豆属 二、胚培养应用 (一)克服远缘杂交不亲和性 (二)打破种子休眠,缩短育种周期:银杏种子离体后需 4-5 个月;油棕种胚需数年。山楂需 2 年。 (三)提高种子萌发率:长期营养繁殖植物形成的种子萌芽率、成苗率低。芭蕉属、芋的种子 三、幼胚培养方法 (一)材料的选择:培育某一时期的胚,则需了解该植物授粉后的天数与胚胎发育的相应关系。 (二)灭菌:授粉后的子房——70%酒精浸泡几秒——0.1%升汞 10-30min——无菌水冲洗 3-5 次——胚的分离与培养 (三)幼胚的分离及培养 1.幼胚的分离; 2.幼胚的培养:异养阶段:幼胚由胚乳及周围组织提供营养。 关键时期:异养阶段 四、影响胚培养的因素 (一)培养基 1.无机盐: Knop, Miller, MS 等。Monnier 研究发现 MS 中适当提高 K+和 Ca 2+,降低 NH4+,可提高成活率和生长。 2.糖:调解培养基渗透压;提供能源和碳源;防止幼胚早期萌发。幼胚期糖浓度高(8%-12%) ,成熟期糖浓度低。 3.氨基酸:谷氨酰胺 500mg/L,水解蛋白 50-500mg/L 4.维生素:硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等 5.植物生长调节剂:关键是保持幼胚期内、外源激素的平衡 (二)环境条件:温度 第二节 植物胚乳培养 一、植物胚乳培养方法 1.胚乳培养是指将胚乳组织从母体上分离出来,通过离体培养,使其发育成完整植株的技术. 2.胚乳外植体的获得 3.胚乳愈伤组织诱导及形态建成 案例:柚的胚乳愈伤组织转到 MT+GA3 1.0mg/L 培养基上,分化出球形胚状体。 (檀香、橙、桃、枣、核桃、猕猴桃等) 二、影响胚乳培养的因素 1.培养基与培养条件 2.胚在胚乳培养中的作用:带胚的胚乳培养比不带胚的胚乳培养更容易形成愈伤组织。尤其对于成熟胚乳特别是干种子中◇=△▲的胚乳更重要。 3.胚乳发育程度 a.早期:不容易诱导出愈伤组织;b.旺盛生长期:最适时期,如苹果、葡萄等愈伤组织诱导率达 90-95%;水稻为授粉后 4-7 天。 c.成熟期:诱导率低,苹果后期 2-5% 三、胚乳培养的应用 1.作为园艺植物的栽培品种:三倍体无子果实;表现出多倍体特点。 2.为育种提供试验材料:杂交利用;胚乳再生植株的倍性较复杂,细胞筛选。 3.产物的代谢合成机理研究。如淀粉等。 第三节 植物胚珠和子房培养 意义:防止杂种胚早期败育,获得杂种后代;为试管受精提供技术基础;未受精的大孢子或卵细胞增殖,形成单倍体; 一、胚珠培养 1.材料的选择和灭菌;2.培养基对胚珠培养的影响;3.胎座和子房对胚珠培养的影响;4.胚发育时期的影响; 5.罂粟,授粉后 2-4 天培养较难。而第 6 天的胚珠从胎座上切下,置于 Nitsch 培养基,培养 20 天后成熟,可萌芽成苗; 6.带有胎座或子房的培养基较简单,更容易发育成种子。 二、子房培养:即将子房从母株上分离下来,置于培养基上,使其进一步发育成幼苗的技术. 方法: 子房外植体的获得: 未受精的子房:开花前 1-5 天; 受精的子房:根据目的,花后数天内; 次氯酸钙等 15 分钟,灭菌后去掉花萼、花冠或颖壳 25-30℃; 光照 黑暗、弱光、正常光照培养 自养阶段:胚能吸收无机盐和蔗糖。 自养阶段。因植物而异,荠菜在球形期以前属于异养,到心形期才转入自养。 第四节 植物离体授粉 一、离体授粉的类型 体受精或试管授精。 根据离体花粉授于雌蕊的位置,可分为: 1.离体柱头授粉:花即将开放前(花药开裂前)切取父本花蕾,灭菌,授粉; 2.离体子房授粉:油菜与甘蓝间的杂交后代; 二、离体授粉的方法 离体授粉的程序 1.确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间. 2.去雄后将花蕾套袋隔离:花前数天去雄. 3.制备无菌子房或胚珠:花后1-2天取花蕾,灭菌。柱头授粉要避免药剂伤害柱头;剥离胚珠;接种. 4.制备无菌花粉:花蕾开放前,取出花药置于无菌培养基上. 5.子房(或胚珠)的试管内授粉:播撒在柱头、子房、胎座、胚珠上或周围. 成功标志是授粉后由胚珠或子房形成有活力的种子。发育成种子,或授粉一段时间后胚原位萌发。 三、影响离体授粉的因素 1.外植体 2.培养基 3.培养条件 第一节 柱头,胎座,发育时期 Nitsch,White,MS 等,花粉的有效萌发。糖 4-5% 黑暗或 100Lx,10-12h/d 光照,20-25℃ 3.离体胚珠授粉。 意义:克服远缘杂交不亲和。 离体授粉:未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来进行无菌培养,并以一定方式授以无菌花粉,是胚珠在试管内实现受精的技术,又称离 第五章 植物花药和花粉培养 植物花药和花粉培养的概念和应用 一、花药和花粉培养的概念 花药(anther)是指植物花的雄性器官,包括二倍性的药壁和药隔离组织以及单倍性的雄性性细胞-花粉粒(pollen grain). 花药和花粉培养都指在合成培养基上,改变花粉的发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂、分化,最终发育成完整植株。 花药——器官;花粉——单细胞 与花药相比较,花粉培养具有某些方面优势: 1.不存在花药中的有害物质;2.没有药壁、药隔、花丝干扰;3.是诱变育种的理想材料;4.是研究遗传和发育的理想试验体系; 二、花药和花粉培养的应用 1.单倍体植株经染色体加倍可成为双单倍体(double haploid, DH); 2.作物育种:缩短育种周期,提高效率; 3.物种进化研究:单倍体植株减数分裂时,二价染色体多+高度可育性 4.遗传分析; 5.分子生物学:为构建 RFLP(限制性片断长度多态性)和 RAPD(随机扩增多态性)连锁图,提供适宜的群体。 6.植物基因克隆筛选 第二节 花粉小孢子发育途径 花粉形成植株的途径——花粉孢子体发育途径(也称雄核发育) 一、活体小孢子发育途径:花粉母细胞 →四分孢子→单核小孢子 二、离体小孢子发育途径 三、花粉植株形态发生方式 第三节 植物花药和花粉培养方法 一、花药培养 1.确定花蕾大小与花粉发育年龄——醋酸洋红; 2.采未开放花蕾; 3.灭菌,接种; 4.勿伤及花药;固体或液体培养基;25℃;光照或黑暗培养,脱分化、再分化。 二、花粉培养 (一)花粉分离与纯化方法 1.自然散落法: (又称漂浮培养散落小孢子收集法) :花蕾→消毒→取花药→接种在液体培养基(或预处理液) →收集→培养。 效率低,易受花药组织影响 2.挤压法 挤压法:在烧杯中提取液挤压→过滤→离心→清洗→悬浮液培养研磨过滤收集法:在研钵中研磨,同挤压法 3.机械游离: 磁搅拌法 三角瓶+培养液+花药→磁力搅拌器→低速旋转至花药透明 产生该单倍体植株的母体为多倍体 小型搅拌(超速旋切)法:培养液+花药→不锈钢搅拌混合器→切碎花药→花粉游离出来→时间短、得率高、成活率高,应用广泛。 4.小孢子分离和纯化:获得的匀浆→过筛→梯度离心→活力高的花粉悬浮液 (二)花粉培养方式 1.平板培养 :固体培养基; 2.液体培养:易出现通气不良; 双层培养:下层为固体,上层为液体 3.看护培养;4.微室培养; 5.固体培养基培养; 6.液体培养基培养:缺点:培养基少,影响进一步发育 7.条件培养基培养:在预先培养过花药的培养基中、或在加入失活的花药提取物的合成培养基中,接入花粉进行培养 三、移栽驯化:花粉植株移栽驯化方法与其他组培苗相同 关键:空气湿度、土壤湿度、温度、光照强度 四、白化苗现象:花粉植株叶绿体发育不完整、缺少叶绿素而出现白化的现象。禾本科类植物较多。 白化花粉植株的亚微结构特征:微核存在;叶肉细胞中原质体停止发育;质体中缺乏核糖体等。 白化苗产生的影响因素及机理 白化苗的控制: 小麦: 材料部位 (主茎等) ; 时期 (单核中晚期) ; 幼穗预处理 (4℃, 24h) ; 脱分化阶段, 29 ℃, 暗培养, 2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 或 6-BA,蔗糖 11% → 9%;愈伤组织产生后及时诱导再分化。 五、影响雄核发育和花药和花粉培养的因素 (一)基因型 (二)植株生长条件和生理状态:光周期、光强度、温度、矿质营养等 (三)花粉发育时期 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期: 1.减数分裂期:草莓、番茄; 2.四分孢子期:葡萄; 3.单核早期:石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯; 4.单核晚期:荔枝、茄子、青 椒、小麦; 5.单核早期至单核晚期:烟草; 6.单核早期至双核期:梨、水稻、甘蓝; 7.四分孢子期至双核期:玉米 (四)预处理 1.高低温处理 低温预处理(1-14 ℃ ,数小时至数天) 、低温后处理、热激处理(30-35 ℃ ,数天) 。 2.化学物质处理:高糖:接种前数分钟至数小时后,转入正常浓度的培养基中;甘露醇:在麦类上的效果比低温效果好;秋水仙素;乙烯 利;EMS;酒精;γ 射线;离心;磁场; (五)培养基 1、基本培养基 2、碳源:单子叶比双子叶要求高。烟草 3%,玉米 6% -15%,在麦类花粉培养中麦芽糖比蔗糖更好, 3、氨基酸:谷氨酰胺、 丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸等 4、植物生长调节剂:禾本科多用 2,4-D(0.5-1.0mg/L 或 5.0mg/L) ,或 6-BA+KT 等 5、活性炭; (六)培养条件 1、温度;2、光照;3、植板密度:大麦小孢子最佳植板密度个 5× 104/ml ~1× 105 个/ml;愈伤组织块植板密度 12.5-25 块/cm2 第四节 单倍体植株鉴定和染色体加倍 一、花药和花粉植株的倍性鉴定 1.染色体直接计数法; 2.间接鉴定:扫描细胞光度仪鉴定;细胞形态学鉴定:保卫细胞、单位面积气孔数等;植株形态学鉴定法;高/低温胁迫法 杂交鉴定法:自交(自花授粉植物) 、侧交(雌雄异株植物) ;分子标记鉴定 二、花药和花粉植株的染色体加倍 1.茎段培养:利用核内有丝分裂,及花粉核的融合所形成的二倍体细胞,诱导产生二倍体植株。 2.化学试剂诱变:秋水仙素诱导、除草剂诱导 第六章 植物细胞培养 植物细胞培养:是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞(或小细胞团)进行培养,形成单细胞无性系或再生植株的技术。 细胞培养的意义:1.细胞生理代谢研究;2.基因改良育种;3.次生代谢产物生产; 第一节 植物细胞培养 一、单细胞培养 (一)单细胞的分离 1、机械法:叶片表面消毒→研钵+10g 叶片+40ml 研磨介质轻轻研磨→双层纱布过滤→低速离心→收集底部游离细胞 研磨介质:20μmol 蔗糖+10μmolMgCl2 + 20μmolTris-HCl 缓冲液,pH7.8 2、酶解法:叶片表面消毒→ 撕去下表皮→ 切成 4× 4cm 块→ 放入灭菌过的酶液中→ 真空泵抽气→ 酶液:果胶酶 0.5%+甘露醇 0.8%+硫酸葡聚糖钾 1% 摇床上保温 30 min → 弃掉第一次 酶液→ 第二次新酶液摇床上保温 30min → 游离出海绵薄壁细胞→ 第三、四次新酶液中游离出栅栏细胞。 注意:必须给予渗透压保护。加入硫酸葡聚糖钾。 6、pH:不同植物要求不同。曼陀罗 5.8 最佳,油菜 6.2 (二)单细胞培养 1、平板培养:过滤后的细胞悬浮液→ 琼脂培养基灭菌→ 冷却到 35℃(在恒温水浴中) → 接种细胞悬浮液→ 混匀→ 倒入培养皿一薄 层(1mm) → 封口膜或石蜡膜封口→ 25℃暗培养 培养过程中注意事项:培养基有利于低细胞起始密度条件下的细胞生长;选用处于分裂旺盛的细胞;适宜的细胞起始密度,烟草 0.5× 104~1.0× 104 个/ml;严格控制接种时琼脂培养基温度,< 35℃。 2、看护培养:看护的愈伤组织可以为单细胞提供营养物质和促进细胞分裂的活性物质。 3、微室培养; 4、条件培养基培养 二、细胞的悬浮培养(suspension culture) (一)悬浮培养方法:即将游离的植物细胞按一定的细胞密度,悬浮在液体培养基中进行培养。 由试管的悬浮培养,发展到发酵罐培养,正成为一门新兴产业。 优点:大量提供均匀一致的细胞;细胞繁殖速度快;适宜大规模培养。 可分为几种类型:分批培养、半连续培养、连续培养 1、分批培养:悬浮细胞 →一定体积(20-75ml)培养基→ 增殖→ ◆●△▼●少部分继代(稀释 5 倍) 细胞分裂呈现周期性变化,细胞数目变▪▲□◁化过程大致呈“S”型,经过延滞期、对数增长期、直线生长期、缓慢期、静止期。 存在的不足:细胞生长代谢不稳定,培养基成分不断改变等 2、半连续培养:利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。培养一段时间,当培养罐内细胞数目达到一定量后,倒出一半细胞悬浮液于另 一个培养罐内,再分别加入新鲜培养基继☆△◆▲■续培养,如此反复进行。 3、连续培养:利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。 特点:连续培养中不断加入新鲜培养基,排掉旧培养基,保证养分的充足供应,不会出现养分亏欠现象,使细胞保持对数生长期中。适宜 大规模工厂化生产。 (二)悬浮细胞的继代:适宜的继代周期一般为 1~2 周 影响因素:接种量。悬浮细胞系体积与新培养基 1:4,培养时间为 1 周;1:10 为 2 周;整个生长期长短受起始细胞密度、延滞期长短、生 长速率等影响。许多细胞系经历 18-25d 可使 0.5× 105 个/ml 达到 1× 106 个/ml ,静止期细胞时间更长,而对数生长期细胞只需 6~9 天。 防止污染: 瓶口、移液管、手指触摸等。 (三)培养细胞的同步化 同步培养指在培养基中多数细胞都能同时通过细胞周期的各个不同阶段, 同步性程度以同步百分数表示。 实现悬浮培养细胞同步化的方法: 1、饥饿法:先停止供应一种营养物或激素,一段时间(数天)后再加入。 2、抑制法:DNA 合成抑制剂,如 5-氨基尿嘧啶等。需要生长时再除去抑制剂. (四)培养基的振荡 1、旋转式摇床:用于分批悬浮培养,水平板上安装瓶夹,转速 30~150r/min, 冲程范围 2~3cm。 2、慢速转床:与轴呈 12° 角安装平板转盘,其上有固定瓶夹,1~2r/min 3、自旋式培养架:适用于大容量(4.5L)的培养,轴与水平面角度为 45 ° ,80~110r/min 三、影响细胞培养的因素 1.培养基: a.适合愈伤组织的培养基,不一定完全适合悬浮细胞培养,但能诱导愈伤组织的培养基,可作为选择依据; b.单子叶植物:N6、MS、B5,双子叶植物: MS、B5、 LS、SL; c.附加水解酪蛋白、椰子汁等; d.需要更高的硝态氮和氨态氮(60mmol/L), (MS 中硝酸铵为 20mmol/L) ; e.磷酸盐消耗快,所以特为高等植物设计了 B5 和 ER 两种培养基; 2.细胞密度: a.起始细胞密度对单细胞培养成败有重要影响; b.起始细胞密度是指细胞培养最低的有效密度,低于此浓度细胞不能分裂,甚至很快解体死亡; c.一般最低有效密度为 0.5× 105~1× 105 个/ml; d.起始细胞密度与植物种类和培养方式有关,条件培养的密度低; e.与培养基成分有关;起始密度低,需要培养基成分复杂。 3.植物生长调节剂:影响细胞分散性。如培养颠茄细胞时,2.0mg/LNAA 条件下,KT 为 0.1mg/L 时分散性好。 4.pH a.常用的培养基缓冲能力很弱,不适合细胞悬浮培养。 b.硝态氮和氨态氮之间的调节可作为稳定 pH 的方法; c.加入固体缓冲物,如微溶的磷酸氢钙、磷酸钙、碳酸△▪▲□△钙等。 第二节 植物细胞生长和活力的测定 一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数:悬浮细胞培养液 → 按 1:2 体积加入 5%~8%三氯化铬(或 0.25%果胶酶)增加分散性→ 70℃加热 2~15min →冷却后用力振 荡 10min →血球计数板计数。 2、细胞密实体积(每毫升培养液中细胞总体积的毫升数): 均匀分散的细胞悬浮液→ 15ml 刻度离心管→ 2000g 离心 5min →细胞总体积数 3、 细胞鲜重和干重:悬浮培养物→已知重量的尼龙网→水冲洗掉培养基→线h →干重 干重单位:每毫升培养物或每 106 个细胞的重量 4、细胞有丝分裂的指数:即在一个细胞群中,处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。 一个迅速生长的细胞群体,其有丝分裂指数为 3%~5%。 该指数可反映细胞分裂的同步化程度。 5、细胞植板率:即每个平板形成的细胞团数占每个平板接种的细胞总数的百分率。 初始的细胞密度高,可获得较高的细胞植板率。 二、培养细胞活力的测定 1.四唑盐还原法(TTC 法) :活细胞呼吸产生的还原力,还原TTC成红色。显微镜下计数被染色细胞百分率;或用乙酸乙酯提取后,分光 光度计(520nm)测定。 2.荧光素二乙酸法(FDA 法) :FDA 进入活细胞被酯酶分解成荧光素,不能自由出入或细胞。发出绿色荧光。 3.伊凡蓝染色法:死细胞或受损伤细胞吸收伊凡蓝,完整或细胞不能吸收和积累 第三节 植物细胞培养的应用 一、植物次生代谢产物的生产 1.生产天然的植物成分:生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类固醇、糖类衍生物、天然色素等 2.生物转化:利用生物系统通过水解、加氢、羟基化作用、氧化还原、脂化反应等,将有机分子转化成新的有机化合物的过程。 3.上述目的需要通过细胞的工厂化生产实现: 4.筛选高产“细胞株系” 二、突变体选择 细胞系。 优良的“种子”培养 优点:减少嵌合体。 细胞大规模培养。 孚尔根染色法 筛选突变体方法:抗性变异细胞选择。加入对正常细胞有毒害作用的物质。已选出抗氨基酸类似物、抗抗生素、抗除草剂、抗高盐浓度等 突变体的近一步鉴定。 三、诱导多倍体 第四节 人工种子 一、人工种子的概念和意义 人工种子又称合成种子,是指植物离体培养中产生的胚状体,被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中,从而形成能发芽出 苗的颗粒体. 意义:1.不易结实等材料繁殖;2.繁殖速度快,12L 发酵罐,20 天产生 1000 万个胡萝卜胚状体;3.固定杂种优势,多代利用F1杂种; 4.一定程度上取代天然种子,节约粮食; 二、人工种子的制备技术 (一)胚状体的诱导:胡萝卜胚轴或子叶→ 2,4-D 0.5~1.5mg/L 的 MS 诱导胚性愈伤 →振荡悬浮培养,诱导体细胞胚 → 每 7~10d 更换一次 培养液 → 多次继代,同步化增殖→ (二)成熟与干燥 体细胞胚→成熟培养基(减少生长素和细胞分裂素,加入 ABA,加入 PEG)→同步化胚,营养成分积累,脱水干燥→成熟胚→ (三)人工种子的包裹 包裹的功用:附加多种营养成分促进种子萌发生长;针对性地加入微量元素,克服土壤缺素;加入农药抵御苗期病虫害;避免挤压;保水。 海藻酸钠是一种较理想的包裹材料。原理:海藻酸钠溶液,滴入适量+2 价 [Ca(NO3)2,氯化钙]或+3 价金属盐溶液,Ca 2+与 Na+交换,呈 凝胶状 常见的人工种子包裹方法: 1、离子交换法:筛选 0.6-2.0mm 胚状体→与 1%~5%海藻酸钠溶液混合(凝胶状) →通过孔径 4mm 滴管滴入 0.1mol/L 氯化钙溶液中→球 状种子→无菌水冲洗 2、干燥法:用 2.5%的聚氧乙烯包裹,然后干燥★▽…◇固化。 3、冷却法:用 0.25%的 Gelrite 胶包埋,冷却固化。 球状人工种子表面,用二氧化硅等材料涂抹成囊膜,润滑、防水分蒸发。 三、人工种子的贮藏与萌发 存在的问题:萌芽率较低,在土壤中成苗率更低;人工胚质量问题,弱苗和畸形苗多;包埋方法、储藏条件需要完善。 第七章 植物原生质体培养及细胞融合 原生质体融合:是指通过物理或化学方使原生质体融合,经培养获得具有双亲全部(或部分)遗传物质的后代的方法,亦称体细胞杂交。 第一节 植物原生质体分离 一、原生质体分离:材料预处理→ 原生质体分离 →纯化 →活力测定 (一)材料来源: 茎、叶、胚、子叶、下胚轴等,愈伤★◇▽▼•组织,悬浮培养细胞;预处理:低温处理(4℃下,黑暗 1~2d)等渗溶液处理(数小时) (二)分离方法 1.机械分离法 元葱表皮细胞——质壁分离——切开细胞壁——释放出原生质体。不适用液泡化程度低的细胞,且产量低。很少再应用 2.酶解分离法:收率高、完整性好、活力强。最有效的方法。 两步法:果胶酶处理→ 单细胞→纤维素酶处理 → 原生质体(因操作繁杂,已逐渐被淘汰) 一步法:常用方法。混合酶液处理 → 原生质体 a.酶液配制 b.酶解处理 纤维素酶+果胶酶+稳定剂→离心(2500-3000r/min) → 0.45μm 过滤灭菌→ 分装→-20 ℃保存 0.5~1g 材料+ 10ml 酶液→ 线h) → 二、原生质体纯化基本过程 酶液处理后:a 未消化细胞、b 细胞碎片、c 原生质体 1.沉降法(过滤离心法) :酶液→ 微孔滤膜( 30-40μm )除去 a →滤液→150g 低速离心 3~5min →弃上清液和酶液 →液体培养基或甘露 醇液悬浮洗涤原生质体,2~3 次→备用(1-2ml) 体,2~3 次(同前)→备用(1-2ml) 原生质体→悬浮洗涤→备用 三、原生质体活力测定 1.荧光素二乙酸法(FDA 法) a.FDA 母液配制:2mgFDA+1ml 丙酮,4 ℃冷藏,短期;染色前配制 0.02% 的 FDA 液(0.1mlFDA 母液+新配制的 10ml 0.5-0.7mol/L) b.染色观察: 取一滴 0.02% 的 FDA 液与一滴原生质体悬浮液在载玻片上混匀→ 25 ℃室温 5-10min →荧光显微镜 330~500nm 波长观察→计 数(黄绿色的活原生质体) 2.酚藏花红染色法 3.形态观察法 (一)供试材料 1.愈伤组织:淡黄色、颗粒状、旺盛分裂的;2.叶片等:幼嫩的、生长旺盛的、最好为试管苗。 (二)酶的种类组合和酶解时间 1.酶的种类:纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶;2.纯度、浓度、活性、组合比例;3.酶处理时间 (三)渗透压稳定剂 1.有机溶液:糖醇或可溶性糖等,如甘露▼▼▽●▽●醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖,甘露醇使用的较多; 2.无机盐溶液:氯化钙、硫酸镁、氯化钾或培养基的无机盐组成。缺点:影响酶活性和原生质体培养效果。 (四)质膜稳定剂:0.5%~1.0%葡聚糖硫酸钾 ,或 0.1% CaCl2· 2H2O (五)pH:一般要求 pH5.5~5.8; 第二节 植物原生质体培养 一、原生质体培养方法 1.平板培养法; 2.液体浅层培养法: 纯化的原生质体→调整密度 (104 个/ml 左右) →吸管移入培养皿, 2~3mm 厚 →石蜡膜带封口 → 26±1 ℃暗培养→5~10 天分裂后,用新的不含渗透压调节剂的培养基置换原液体培养基,每周一次→大细胞团→固体培养基 3.固-液结合培养法:悬浮液+固体培养基等量混匀→迅即移入培养皿→凝固成 2~3mm 平板 →上面加入相同成分的液体培养基(或添加 0.1%~0.3%的活性炭) →石蜡膜带封口 → 暗培养→5~10 天分裂后,用新的不含渗透压调节剂的培养基置换原液体培养基,每周一次→大 细胞团→固体培养基。 优点:分布均匀,有利于分裂;容易获得单细胞株系;活性炭和液体培养基可除去有害物质,植板率高。培养效果最佳。 缺点:原生质体易受热伤害;易破碎。 二、影响原生质体培养因素:原生质体活力、原生质体起始密度、渗透压稳定剂、培养基成分、培养条件、植物材料和基因型 缓冲液 0.05~0.1mol/L 磷酸盐,或 3.0~5.0mmol/LMES 最好不超过8小时。 原理、方法同上。活的原生质体发黄色荧光。波长 527nm 和 588nm 颜色新鲜,形态完整,富含细胞质等。 优点:方便,收率高; 缺点:纯度不高。 2.漂浮法: 20%蔗糖溶液 5ml+离心管→ 1-2ml 酶-原生质体混合液 → 150g 低速离心 5min →移液管吸取上层原生质体液 →悬浮洗涤原生质 纯度高,但收率低。 3.不连续梯度离心法: Ficoll 溶液,构成不同梯度的溶液,试管中→滴入酶-原生质体混合液 → 150g 离心 5min →移液管吸取不同界面的 原生质体均匀一致,纯度高;操作繁杂,收率低。 四、影响原生质体数量和活力的因素 三、原生质体再生 1.细胞壁再生:1~2 天完成,如烟草、矮牵牛等。细胞壁再生是细胞分裂的前提。 2.细胞分裂: 分裂前兆: 2~3d 后细胞质浓厚,叶绿体等细胞器集中在赤道板位置; 第一次分裂:烟草 3~4d,葡萄 4~5d;细胞分裂开始后,要及时降低渗透压。 3.植株再生 第三节 植物细胞融合 一、原生质体融合 (一)融合原理:细胞膜表面有稳定的疏水性基团,具有膜电位,静电排斥使原生质体不能吸附在一起。 1.化学法融合原理:是指以化学试剂作为融合诱导剂诱导融合,主要有 PEG 法和高钙—高 pH 法等。 PEG(聚乙二醇)分子带有微弱的负极性,可以与具有正极性基团的水、碳水化合物、蛋白质等形成 H 键,在原生质体之间形成分子桥, 使原生生质体发生粘连而融合; PEG 可能导致细胞活力下降,对细胞产生毒害作用。 2.物理法融合原理:是指用电激、离心、振动等方法诱导融合,主要有电融合、超声波法等。 与融合相比,优点:不存在对细胞的毒害问题、融合效率高、融合技术操作简便。 (二)融合类型 1.对称融合:融合后产生核与核、胞质与胞质间对称杂种。 原生质体融合后的个体称为融合体。同种原生质体间的融合称为同源融合,该融合体称为同核体;非同种原生质体间的融合称为异源融合, 该融合体称为异核体。 2.不对称融合:通过物理或化学方法处理亲本原生质体,使一方细胞核失活,或同时也使另一方细胞质基因组失活,在经过融合,获得只 有一方亲本核基因的不对称融合体; 无核的亚原生质体成为胞质体; 有核的小原生质体或只有核和原生质膜构成的亚原生质体成为核质体。 3.微原生质体融合:该技术又称为微核技术,是指以植物细胞经微核化处理后形成的外有被膜、内含一条或几条染色体的微核作为供体, 与受体原生质体融合,从而实现部分基因转移的技术。 (三)融合方法 1.PEG 融合法 a.器具灭菌;培养皿、移液管、离心管等; b.原生质体制备;双亲分别悬浮于 0.4-0.6mol/L 的 Monnitol 液中,密度 2× 105 个/ml; c.制备 PEG 液与稀释清洗液; PEG 分子量 1540~6000;稀释清洗液主要由 CaCl2· 2H2O 和 Monnitol 液组成; d.原生质体融合; 两种原生质体悬浮液各取 1ml→混合于培养皿→静置沉淀 5min →四角(或一侧)滴入等量(2ml) PEG 液→吸管诱导 接触、混匀 →镜下观察决定融合时间,大部分吸附成二体、少数三体→分次加稀释清洗液→液体培养基洗一次 →原生质体培养; 注意:双亲外观最好能区分开;操作动作要迅速,轻拿轻放; 2.高钙-高 pH 法:操作过程同上。用高钙(>0.03mol/L)-高 pH(9.5~10.5)液取代 PEG 液。烟草叶肉原生质体 3.电融合法:无化学残毒,重复性好,但设备贵。 过程:制备原生质体、 调整融合参数:电场强度,处理时间、融合处理:等量混匀,滴入融合槽,高压脉冲(10~50>μs,1~3kV/cm) ,原生质体极化、排列、膜 穿孔、闭合、融合、离心洗涤,同原生质体纯化方法、融合体培养。 二、体细胞杂种选择 (一)杂种细胞的选择▽•●◆ 1.互补筛选法 利用双亲在生理或遗传特性方面产生的互补作用进行选择。在选择性培养基上杂种细胞才能生长发育,非杂种细胞不能生长发育。 激素自养型互补选择;白化互补选择;营养缺乏型互补选择;抗性突变体互补选择;基因互补选择。 2.机械筛选法 (二)杂种植株的选择 1.形态学鉴定:株形、叶形、花色等; 2.细胞学鉴定:染色体数目; 3.生物化学鉴定:酶、色素、蛋白质、同工酶等;4.分子生物学鉴定 三、细胞质工程: 又称细胞拆合工程,是通过物理或化学方法将◆▼细胞质与细胞核分开,再进行不同细胞间核、质的重新组合,重建成新细胞。 (一)细胞器基因组的特点 1.核基因组;2.叶绿体基因组;3.线粒体基因组 (二)细胞器分离; (三)细胞器移植; (四)原生质体对微生物的摄取。 第八章 植物离体繁殖 又称植物快繁或微繁,是指利用植物组织培养技术对外质体进行离体培养,使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。 与传统的营养繁殖相比,其特点:1.繁殖效率高;2.培养条件可控性强;3.占有空间小;4.管理方便;5.便于种质保存和交换 第一节 植物快繁的器官形成方式 一、短枝发生型:带叶茎段外植体,在适宜的培养环境中芽萌发,形成新梢,再将其剪成带叶茎段增殖,通过继代培养再成苗的繁殖方法。 该方法与田间扦插繁殖相似,故又称为微型扦插 二、丛生芽发生型:外植体携带的腋芽或顶芽,不断发生腋芽而呈丛生状发,将单个芽转入生根培养基中生根成苗的繁殖方法。是大多数 植物快繁的主要方式。不经过愈伤组织,保持原品种特性。 三、不定芽发生型:外植体经过脱分化形成愈伤组织,然后经过再分化诱导产生不定芽,或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不 定芽,将芽苗移到生根培养基中生根的繁殖方法。 植物快繁的主要方式。增殖率高于丛生芽发生型;变异株率要高。 四、胚状体发生型:外植体在适宜培养条件下,经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。成苗数量大、速度快、结构完整。 五、原球茎发生型:是兰科植物的一种快繁方式,即茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎(即扁球状体、基部生假根)的繁殖类型。 原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官,它可以繁殖形成原球茎丛。 原球茎繁殖体系是兰花唯一有效的大规模无性繁殖方法。 第二节 植物快繁的程序 一、阶段 I —— 无菌培养物的建立 1.母株(stock plant)和外植体的选取;2.无菌培养物的获得;3.外植体的启动生长。一般需 4~6 周,长者需 1 年以上。 二、阶段 II —— 繁殖体增殖 1.培养材料的增殖:4~8 周继代一次; 2.增殖培养基:基本培养基与阶段 I 相同,调整生长调节物质浓度; 3.增殖体的大小和切割方法。 三、阶段 III —— 芽苗生根 1.试管内生根(离体生根) :降低无机盐浓度,1/2 或 1/4。单独用生长素;2.试管外生根(活体生根) 。10-20 天左右生根 四、阶段 IV —— 组培苗的移栽驯化 注意:三控——控湿;控光;控温; 第三节 影响植物快繁的因素 一、外植体 1.外植体的来源;2.外植体的生理年龄;3.外植体大小 临界大小 1~2 个叶原基茎尖(0.2~0.3mm) ;5mm2 叶片、花瓣;0.5cm 茎段 二、培养基:基本培养基、植物生长调节剂 三、培养条件 1.光照:阶段 I 和 II 期间,1000-3000Lx,阶段 III 提高到 3000-10000Lx,自然光; 2.温度:10~35℃,高温容易出现玻璃化苗; 3.湿度:瓶内 90%~100%,环境 70%~80%。 四、继代培养 五、移栽 恒温、高湿、弱光下生长的异养试管苗,出瓶移栽后导致死亡率高的因素包括根系与叶片结构,其与正常根系和叶片之间有较大差异。 A. 根系结构:1.试管苗不生根;2.根与输导系统不连接;3.根无根毛和很少;4.根无吸收功能或极低; B.叶表皮组织:1.叶表角质层和蜡质层不发达或无; 2.叶无表皮毛或极少; 3.解剖结构稀疏; 4.气孔开口大,不关闭; 5.叶片存在排水孔; 6.光合作用能力极低; 第四节 植物快繁的商业化应用 一、商业化生产规模及工艺流程 (一)试管苗生产规模的确定:无菌工作台数量、培养架面积、实验室面积、植物种类与繁殖速度、工作效率等 100 万/年产量:8-10 台工作台,面积 40-50m2;培养架 40-50 个,面积 100-200m2;温室 600m2;塑料大棚;苗圃; (二)商业化生产的工艺流程 二、商业化生产及效益分析 (一)试管苗增殖率的估算:葡萄试管苗,理论上 1 年可繁殖 53 万,但实际繁殖出 3 万株成活苗。 理论计算公式: Y=mXn;Y——年繁殖数量;m——无菌母株苗数;X——每个培养周期增殖的倍数;n——全年可增殖的周期数。 驯化现象 形态发生能力容易减弱或丧失 控湿:塑料拱棚,微喷灌; 控光:遮阳网; 控温:通风、喷灌降温;升温 (二)生产计划的制定和实施:扣除损耗、移栽死亡、未达到标准的苗等;成活苗数=实际生产数量× [1 — 损耗 5%~10%] × 移栽成活率 (三)商业化生产效益分析 1.人工费;2.生产物资费用 药品、低值易耗品、当年消耗品;3.设备折旧费用;4.水电费用; 5.其他费用 办公、培训、旅差、种苗、宣传费等 三、降低商业化生产成本的措施 1.提高劳动生产率;2.减少设备投资,延长使用寿命;3.降低消耗;4.降低污染,提高繁殖率和成活率;5.简化培养基 四、商业化生产应注意的技术问题 污染、遗传稳定性、玻璃化、褐化、黄化 第九章 无病毒苗木培育 第一节 植物病毒为害和脱病毒机理 2.病毒在植物体内的分布; 一、植物病毒分布和为害 1.植物病毒的地理分布; 3.病毒对植物的为害:植物病毒的种类、植物病毒病的主要症状、植物感染病毒后对其生长和经济性状的影响。 三、植物病毒的传播方式和脱病毒机理 1.植物病毒的传播方式: 介体传播:蚜虫 叶蝉和飞虱 土壤中的介体; 热处理:钝化病毒。 非介体传播:机械传播 无性繁殖材料和嫁接传播种子和花粉传播 2.植物脱病毒的机理:病毒在植物体内的分布是不均匀的,在茎尖中呈梯度分布。 茎尖培养:去除病毒; 三、植物脱病毒的意义 1.脱毒的重要性:长期无性繁殖病毒积累,导致种性退化。没有有效的防治药剂,培育无毒组培植株是最有效的防治病毒方法。 2.脱毒的经济意义:提高产量 20%-300%;提高品质;增强抗逆性等。 第二节 植物脱毒方法 一、物理方法:通过热处理,即热疗法。35-40℃数小时至数天 二、化学方法:2-硫尿嘧啶;放线菌素—D;放线菌酮等 三、生物学方法 1.茎尖组织培养脱毒法:切取茎尖分生组织及其下方的 1~3 个幼叶原基。 2.愈伤组织培养脱毒法:约有 50%细胞或再生植株不带病毒 3.微体嫁接离体培养脱毒法:将极小的(<0.2mm)茎尖嫁接到实生苗砧木上,无菌培养。 4.珠心组织培养脱毒法:病毒通过维管组织移动,珠心组织与维管没有直接联系。葡萄、柑橘等 四、综合脱毒方法:茎尖培养结合热处理脱毒法 第三节 脱病毒植株的检测和保存 一、脱病毒植株的检测 1.直接测定法:植株症状;2.指示植物法; 3.血清鉴定法:利用抗原与抗体的体外结合,产生特异性沉淀,应用荧光素、酶标记或在电子显微镜下观察抗原和抗体结合等方法提高反 应灵敏度; 4.核酸分析法:核酸杂交和 PCR 方法检测病毒核酸; 5.电镜鉴定法。 二、脱病毒植株的保存 1.脱病毒植株保存:田间种植,防虫网或温室用 35-400 目尼龙网 2.脱病毒植株繁殖。

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