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鸢尾属(iril)部分植物组织培养及耐荫性的研究pdf

发布时间:2019-09-19 23:43 浏览次数:

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  摘要 本文在对南京、杭州、无锡等地鸢尾属植物及其园林应用实地调查的基础上,以黄菖 鸢尾(扫妇据cfo,“聊)等五个种(品种)为实验材料,从其部分种(品种)的组织培养技 术和耐荫性两方面入手,通过大量的实验并对所得数据进行统计分析,得出以下结论: 溪荪的组织培养中,以春季萌发的茎尖为外植体,以Ms培养基附加低浓度的 浓度最佳。 苗最理想,外植体的取材时期对分化和增殖效果影响很大,以春季取材为最佳。在不定芽 的增殖培养中,培养基中添加适量的KT(2m∥L)更有利于不定芽的增殖。在生根培养中以 6.BA(0.1mg几)与NAA(0.5mg几)的组合为最佳。 花菖蒲的组织培养中在以茎尖为外植体时,Ms培养基附加6.BA2.5m∥L与 NAA0.1~0.2mg/L时效果较好,产生了少量的愈伤组织,但褐化问题严重,实验中采取 了添加活性炭和频繁转瓶的方法来降低褐化带来的干扰,但效果不明显。 通过对鸢尾属五种植物的叶片单位面积鲜重、干重及含水量,叶片解剖结构,叶绿索 含量(a+b)及叶绿素a,b,叶片光合特性多项指标研究得出:鸢尾属五种植物的耐荫性由 菖蒲(扫妇妇P嘲廊rj)溪荪(扫括船,培“f玎8口)。 关键词:鸢尾;组织培养;外植体;耐荫性;光合作用 on C。ltlj:eandShadotolorance StudiesTiosue ofthe办西p!ants ASSTRACT Ontbebasisof meresourcean硅utilization in in、,estigating of一括plantsNanjin吕 five a11d select。d Wu垴,the HallgzIlou p印er plants:打捃芦8“出c。,蚶、打捃踟门∥加已d、一打 ,,括阳以Dr“川tofindtheirtissueculture andshade 妇P疗E驴rf、扫曲,印。胛七日、 technology tolerancewith10ts resuItsweresumm“zedasf01lows: experiments.The Inmeculture inthe andthemedim of一括脚,鼎加口4,Theshootingtip spring with the of suppkmented period wasbetce“othetal(e tllaIl thc showedthatNAA rootof root,it IBA,aIld taking youIlgplants bestconceI心ationwas tome O,5m∥L motingyoungplams. In culturc sho甜ngtip best.ThetiIncof made e彘ctonitsdi髓rentiationand e腩ct, expIa芏1ts sigIlificant production inducementofadvemitiouswith a11d was best.Inthe bud,MSappmpriate springproved wasbe柱ertoadvemmousbuds’ Thebestconcen仃ationw踮 KT(2m扎) production. the NAA(O.5mg/L)to 6-BA(0.1mg/L)and motingyoungplants. Inmeculttlre meseledionof hada eff毡ctonthe of打括勋已疗t圮屉rt explantsgreat int11einducememof linlecallus experinlent.While shootingtip,themedi哪pmducedsupplied witll6一BA 0.1~0.2mg,L.However’itproducedbrowningproblems,al也ou曲 2.5mg几+NAA and caIlreducet王le didll’t activecarbontr锄sfbrringfkquently browninge行bct,it adding di豌redmuch. the onthe舭sh aIldwater to coment,theleaf姗cture, AccordingstLldy wei出、drywei曲t t11e aIldvalueof characteristicof corltent leaves,The chlorophyll C“Cb,Ⅱ1ephoto哪tllesis shadetolerantoffive to wasinIhe ability plants(fmmstrongweek) order:一括御oHfc口、,r扭 tectorum、Iris勋empjiri、酗ssdngutnen。 pSeudacorus、Iris tissue shade cul眦; tolerance; Ke)word:一扫; explant; photosynthesis Y 致谢 在三年来学习和生活以及论文工作中,恩师芦建国副教授给予了我诲人不倦的指导和 无微不至的关怀,他那师恩如山的言传身教,使得我在顺利成长的同时,更是终生受益, 借此深深感谢恩师对我三年如一日的关心扣支持j 本论文的开题,实验方案的确定得到了南京林业大学汤庚国教授、季孔庶副教授、江 苏省中国科学院植物研究所黄苏珍研究员的指导,并提出了宝贵的意见。本论文在组培实 验部分得到了竹类研究所张春霞副教授的悉心指导,保证了组培实验的顺利进行;在耐荫 性的研究部分得到了生理教研组谢寅峰副教授的指导,植物学教研组彭冶、赵治芬老师为 石蜡切片实验的完成提供了很大的帮助:在实验后期的显微摄影过程中,得到了森环院显 微镜室张雪英老师的大力帮助。感谢潘健博士、赵渊、扬静、芦娟娟、、潘向艳、黄 岩、王玉红、彭丽、孙强、庄栋等同学在试验中所提出的宝贵意见和给予的热心帮助. 特别要感谢我的家人,是他们的关爱陪伴我渡过最困难的时光,感谢他们一直以来对 我的支持和鼓励,使我得以顺利完成学业。 在此,谨向所有提供指导和帮助的老师乖同学们致以诚挚的谢意! 作者:李雪莹 二oo六年六月 引 言 鸢尾属(,,括上.)是鸢尾科(打f如cea8)中最大的一个属,该属植物均为多年生草 本,大多数鸢尾为宿根花卉,也有常绿的鸢尾种。全世界约有300个种,主要分 布于亚洲、欧洲和北美洲等北温带地区【loJ。我国约有60个种,13个变种及5 个变型,主要分布于西南、西北及东北地区pJ,在我国所拥有的鸢尾属植物资源 中富含了鸢尾属下无附属物亚属、琴瓣鸢尾亚属、尼泊尔鸢尾亚属、野鸢尾亚属、 J。 鸡冠状附属物亚属以及须毛状附属物6个亚属的植物种类13 关于鸢尾属(打打工.)植物的记载最早可以追溯到公元六世纪,希腊人 of Codex Dioscoride所著的《Viennadioscorides》中记载了该属植物具有治疗多 种病症的作用【“。l Turner的著作中把鸢尾属植物作为药用资源 551年wyllianm 【51 61,而1576年carolusClusius第一次把它作为观赏植物收载于文献之中。1753 年LinneCarlvon.在他的《Specjes 等都是这一期间发现的。1 记载了本属的39种植物,其中有27种产于我国,这篇文章对研究我国的鸢尾属 植物具有重要的参考价值。1913年H.R.Dykes发表的鸢尾属专著中把属的范围 略加缩小,记载了大约140种,其中有很多原产地是我国【2,7,8,9】。 所有鸢尾植物均为多年生草本。大多数鸢尾为宿根花卉,也有常绿的鸢尾种。 鸢尾的叶呈剑形,嵌叠状排成一个平面。鸢尾花形奇特而美丽,它的花从两片苞 片中抽出。有的种花葶上开l朵花,有的数朵花排成一大花序。鸢尾的花被花瓣 状,共6枚,外面3枚比较大,一般向外弯曲下垂,称之为垂瓣;里面的3枚花 瓣通常小一点,直立成拱形,称之为旗瓣。垂瓣的基部常有一些醒目的附属物, 它们的形状很不相同:有的呈髯毛状,有的呈鸡冠状,但颜色都很鲜艳。这些附 属物是鸢尾属分类很重要的特征。即使有的鸢尾没有附属物,它们的垂瓣基部也 常有色彩鲜艳的耀眼斑纹,以此招引昆虫前来传粉。鸢尾★▽…◇的花柱3裂,扁平,像 花瓣一样美丽,裂片向外开展,分别覆盖着3个雄蕊,所以鸢尾花自花授粉的概 J。 率很低。鸢尾花子房下位,3室。果实为蒴果,上有3~6个棱【3,9 鸢尾属植物具有多种用途,但主要用途是观赏,因鸢尾属植物多数都具有美 丽的花朵,丰富的色彩,叶片青翠似剑,观赏价值高。在园林中可丛栽、盆栽布 置花坛、栽植于浅水区、河畔池旁,也可布置专类园,也可植于林荫树下作为地 被植物。目前广泛应用于观赏的主要有花菖蒲(一如妇e埘口斥,f)、溪蒜(打括 尾(一趣譬gr删疗拧fc口上。)为主的须毛类鸢尾。此外,其不同物种植株的根、茎、叶和 种子还分别用于酿酒、提取芳香油【4】、天然药物【5,6,”、食品、维生素、染料、造 纸及纺织工业峥’”1等。 上篇鸢尾属植物的组织培养 第一章文献综述 1鸢尾属植物研究进展 鸢尾属m捃三.)植物在全世界约有300余种,而应用到园林中栽培观赏的鸢 尾,只占其中的很少一部分,但鸢尾品种却在近loo年来以惊人的速度发展起来。 现在,全世界鸢尾品种己达20000多个,并还在以每年700多个品种的速度增加。 这些鸢尾新◇…=▲品种的色彩日益丰富,观赏性越来越高一』。 鸢尾属(打如工.)最早的属下分类系统是1 此系统把该属植物分为三大类群:(1)Co阳,班6口,6口ffs在外花被裂片上有带色 的多细胞的须毛(2)Coro,,如f卅6Pr6汤“s外花被片上无须毛(3)pm抽“scD册f胁P 以上两群以外的全部种类。l l 设5个亚属。1961年的Rodioninko将属下划分为6个亚属,亚属下设有组和系。 我国对鸢尾属植物的研究起步较晚,最早的系统研究该属植物的文章是1936 年刘瑛在《中国植物学杂志》上发表的《中国之鸢尾》,文中记载了鸢尾属植物 35种。二十世纪八十年代经过长期、系统地对该属植物的研究,赵毓棠在《中 国植物志》中采用了Rodioninko的系统,对鸢尾属各个种的分类地位作了调整, 二十世纪八十年代以来,国内研究该属的工作逐渐增多,主要集中在以下几个方 面【II】: 1.1引种及驯化栽培 黄祥童【12】和邢吉庆[13】对分布长白山区的7种野生鸢尾以及秦岭地区4种野 生鸢尾进行本地区内的引种栽培。结果表明分布在本地区(东北、华北等地区) 内野生鸢尾的引种,几乎不受海拔高度差别的影响,均可获得引种栽培的成功, 其生物学特性没有变化。黄苏珍对国内东北西北华北华东以及西南地区35个野 生种进行了引种栽培的试验,结果表明驯化栽培过程中适当的保护性栽培是引种 栽培成功的关键所在,西北、西南及东北地区高海拔分布种在南京地区的驯化栽 培一般需要2~4d的时间。试验还表明,西南高海拔地区分布的物种直接引种到 海拔和纬度较低地区种植的成功率比较低,应采用分布引种的方法进行较为适宜 【l¨。此外,朱官有、卞勇[“1等对黄金鸢尾引种驯化栽培进行了试验和研究,丰 富了当地的植物种类。林兵、黄敏玲【l5J等观察了荷兰鸢尾在福州地区的引种栽 培的适应情况,并分析了种球大小对开花的影响,结果表明:荷兰鸢尾能很好地 适应福州地区露地栽培,生长发育正常。 2 1.2细胞学研究 国内对鸢尾属植物的细胞学方面的研究是比较系统和全面的,对^抽s口.进 行了核型研究,为打括sp.的形态分类奠定了基础Il“,并对紫花鸢尾体细胞的染 色体数目Ⅲj、东北产鸢尾属植物染色体数目【18j进行了研究,对紫苞鸢尾和矮紫 苞鸢尾的形态特征、分布范围、核型特点等进行比较研究,对细叶鸢尾的染色体 核型进行了分析【l…,通过染色体数目及核型的分析,就可以从微观方面对物种 加以鉴别,并为了解种问亲缘关系和进化提供依据f2o】: 同时用饱和对二氯苯溶 液,卡诺氏固定液及盐酸处理,用改良苯酚品红染色液染色、压片镜检的方法对 射干BP肠肌c4H幽c矗砌P行J曲r£.JDC.和鸢尾打括地c肋,“mMaxim.的染色体数目和 核型进行了研究【2”。另外依据经典分类学理论,结合结构植物学方法,对中国 北方l5种鸢尾属植物在分类学地位、解剖结构与生活环境的关系等方面进行了 分析和讨论【2”,并对我国部分鸢尾属植物系统位置进行研究【23】;许多方面的研 究都将随着细胞分类学的发展而对传统分类学有着积极的影响,人们的研究逐渐 成为通过染色体数目及核型的分析,从微观方面对物种加以鉴别,并为了解种间 亲缘关系和进化提供依据【I91,同时也为育磅打下了细胞学和遗传学基础。 1.3繁殖方法 鸢尾属植物可以采用播种和分株的方法进行繁殖,但鸢尾属植物的种皮对种 子的萌发有很大的抑制作用【242”,而分株繁殖的速度又慢。多年以来,人们一直 研究组织培养的方法来进行繁殖,并取得了显著的成就。江明和谢文申【”J在对 香根鸢尾的组织培养和快速繁殖时采用低温黑暗培养和光照相结合的方法诱导 丛芽的分化,结果表明:接种在诱导培养基上的根茎所产生的单生芽经低温黑暗 培养30天后再移至光照条件下培养,可促使丛芽分化,使形成丛芽的时间缩短 一半,丛芽诱导频率提高到15%左右。激素配比的实验表明:当BA浓度一定时, 增值倍数随NAA浓度的提高而降低。以BA与低浓度的NAA配合使用效果较好。 7,2 袁梅芳128】等对上海地区球根鸢尾的病毒鉴定及试管脱毒成球技术进行了深入 的研究,经检测初步确定球根鸢尾普遍存在鸢尾重花叶病毒、鸢尾轻花叶病毒、 水仙潜隐病毒三种病毒的复合侵染。对带毒种球进行茎尖组培脱毒,得出了茎尖 诱导成芽、芽成球及小球生根的培养基配方。将组培苗在试管苗:成球苗、移栽 茁等不同时期进行病毒检测,结果表明,小于1.0mm的茎尖诱导的幼苗可脱去 上述三种病毒。陈德芬【29J等也对外源激素对鸢尾组织培养的影响进行了研究, 由于鸢尾▪…□▷▷•品种间内源激素水平不一致,而影响分化的时间,德国鸢尾从接种到分 化需20天,法国鸢尾需25天,意大利鸢尾则需30天以上。黄苏珍po,”,驯等分 别对荷兰鸢尾、德国鸢尾、杂种鸢尾的组织培养进行了系统的研究,其中荷兰鸢 尾采用鳞片做为外植体,德国鸢尾和杂种鸢尾均采用茎尖做为外植体,在实验中 发现取材部位及外植体块的大小均对诱导分化产生影响,同时不定芽大小对增殖 速度也有影响。张金政[33】、徐立军【341等在对德国鸢尾的不同品种进行组培研究 时,均采用花器官做为外植体,由于德国鸢尾具有较强的分化能力,所以也取得 了实验的成功。 1.4病虫害研究 在鸢尾属植物病虫害研究方面,徐志新135】发现球根荷兰鸢尾易患黄化腐败 病。郭坚华【36】等从南京地区鸢尾病叶上分离到一种黄色细菌,根据柯赫法则鉴 定证明为鸢尾叶疫病病原菌。经鞭毛染色、革兰氏染色试验,菌体形态和培养性 状观察及一系列生理生化反应测定结果,证实该病原菌为油菜黄单胞菌鸢尾致病 变种。王福玉[37】等也对球根鸢尾虫害防治技术进行了系统的总结概括。黄苏珍【10】 从德国鸢尾栽培品种软腐病感病症状植株上分离到的细菌菌株,结合菌株形态、 致病性、染色反应、培养性状及生理生化反应结果,将该菌株初步鉴定为:欧文 氏菌菊欧氏杆菌。 1.5杂交育种工作 鸢尾属植物的杂交育种研究在国外从19世纪初就已经开始,并培育出了数 千个品种。我国鸢尾属植物杂交育种是从20世纪90年代开始,主要的报道有: 黄苏珍、顾姻【3s,39】等进行了鸢尾属种间杂交和种内杂交计21个组合,授粉花数 229朵,结实数19个。种内杂交结实的3个组合,平均结实率64%;种间杂交 结实的3个组合,平均结实率1.5%。有3个种内杂交组合、2个种间杂交组合 的种子己萌发成苗。对亲本及F1代植株进行了同功酶的鉴定,鸢尾(一妇旭c幻r“m) 南京进行了鸢尾属(扫打三.)的种间与种内杂交育种试验。结果表明:2个种间 杂交组合亲和力极弱,Fl代杂种苗生长不良,6~8周内死亡。3个种内杂交组 合亲和力较强,Fl代杂种苗生长良好,其中2个杂交组合F1代的花色由单基因 控制,末出现花色的分离;不同花色的德国鸢尾(打捃gP,所口订fc口三.)品种LP和 PP之间的杂交组合F1代花色受多基因控制,Fl代杂种花色出现明显分离,从 中选出了“紫金”、“彩带”、“金舞娃”、“红浪”、“水晶球”、“紫云”和“紫盘”7个新 栽培品种。柯立明、杨秀莲【40】运用常规胚胎学的研究方法,在人工授粉条件下 用明视显微镜,荧光显微镜和扫描显微镜观察了鸢尾属内3个亚属间杂交组合不 亲和性的障碍。’结果表明鸢尾种间杂交的障碍包括花粉管在柱头上的异常行为, 柱头乳突细胞和花粉管的胼胝质反应,以及胚囊的解体等。种间传粉的不亲和程 度,因不同组合而有差异。黄苏珍、韩玉林…】等又以2个矮生和5个普通德国 鸢尾m妇卫erm日订fc口三.)栽培品种为材料,配置5个杂交组合,经杂交试验及 矮生优株筛选,选出矮生优良单株8个。试验结果表明:因所选亲本遗传基础的 复杂性,其杂种后代出现了花色及株高等主要表型性状的高度分离;在花色性状 遗传中,其紫色相对于黄、粉、自和红色具△▪▲□△有更强的遗传能力;在株高性状遗传 中,杂种后代不同株高个体数由多到少依次为III级、II级、IV级、I级。以花 4 色为主要观赏指标的鸢尾矮生植株需通过与矮生亲本的反复★◇▽▼•回交筛选得到。 2植物组织培养研究进展 植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术,它是在人 工配制的培养基上,于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料 的方法f4引。 2.1离体无性系快速繁殖与无毒化 用★△◁◁▽▼组织培养得到的离体无性系可以加快繁殖植物并使之脱病毒复状。当感染 病毒的植物在高于正常温度下生长,这种植物可不受伤害而病毒的增殖则部分或 完全受到抑制。为此可以切取更大的茎尖作为处植体进行组织培养。这种外植体 不仅易于操作而且生长更快。分化组织、茎尖和芽培养几乎为多种植物的所有基 因型(品种)提供了有效的快速繁殖方法。由于这种技术的无菌操作条件,因此可 以有效地大量扩增没有病毒感染的植物品系【4”。例如苹果如被病毒感染后一般 要减产14%~45%,而且品质恶化后不耐储藏。如采用无毒化与快速繁殖,有的 试验从一个茎尖一年中可以得到2万株以上种苗,减少大量损失,已推广3万亩 41。 以上【4 2.2花药培养与单倍体植株 单倍体植株由具单倍(单套)染色体的花粉或卵细胞诱导产生的植株。很早以 来,生物学家和育种学家们就希望以花粉或卵这些具单倍体染色体数目的细胞培 植株以来,花药培养这一领域已经取得了很大的进展。特别是游离花粉培养技术 的改进,单倍体植株和纯合植株在单倍体育种中的利用144,4”。 2.3原生质体培养 原生质体的应用首先依赖于它们再生新细胞壁的能力以及以后分裂,生长的 能力。最常见的有两个培养方法。一是把原生质体的悬浮小滴放在培养皿中,然 后用塑料膜封口:另一是把原生质体用一层薄琼脂包埋在小培养皿中。后一个方 法很类似于分离单细胞无性系的平板培养技术。如果培养基中包括有合适的生长 因子,再生的细胞将分裂成小细胞团或较大的细胞团。在很多种由原生质体再生 的细胞中,都观察到了细胞的持续分裂和生长【43,46,471。原生质体的•●培养国内目前 发展缓慢,文献比较少见1444…。 2.4细胞悬浮培养 悬浮培养通常从把已建立的愈伤组织转移到液体培养基开始。悬浮培养基有 两种类型,即成批培养和连续培养。目前,它们都已被普遍采用。在药物生产的 研究中应用最多【43,49,501。草本多年主植物,其根为重要中药,内含具萘环结构的 红色素,可用作创伤、烧伤的药物及治疗痔疮的煎药。1986年南京大学生物系 开始了利用悬浮培养生产紫草宁的研究,中科院植物所及中科院武汉植物所也为 紫草宁工业化生产的研究做了大量的工作。在适当条件下生长的细胞悬浮培养物 中的紫草宁含量占干重的14%,比一般的宿根植物中含量高几倍。 2.5试管受精和胚胎培养 进行了萝h和辣根的胚胎培养。在育种上,莱巴赫用胚胎培养技术解决宿根亚麻 和奥地利亚麻的杂交种子不能萌发的问题,在培养下使它们成熟并得到杂种植 物。莱巴赫的先驱工作为企图用培养离体胚的方法来克服杂交性的障碍奠定了基 21。 础,从而开创了植物胚胎培养应用于实际时代[51,5 3研究的目的与意义 鸢尾属植物具有广泛的用途,优良的性状,人们希望获取更多的种苗,来满 足医药、科研、园林绿化等方面的需求。但鸢尾属植物种子休眠现象是比较普遍 的(I引,种子收获后发芽常需要经过较长时间,即使同一蒴果的种子发芽往往也 的种子只有较少一部分能发芽,大部分可在第二、三年发芽,而剩下的断断续续 要持续20年【25】。因此为了满足市场的需求并扩大其应用的范围,对鸢尾属植物 的▲=○▼组织培养技术有很多深入的研究,部分种类已经达到产业化生产的程度,但仍 有许多种类,尤其以花菖蒲为代表的无附属物亚属鸢尾植物的组织培养技术还不 成熟i仍处于探索的阶段。本文正是以溪荪(,,妇s口H删抽P口)、鸢尾(打捃把f细r“研)、 花菖蒲f,r妇妇P珊口角rf)为主要实验材料,进一步研究鸢尾属植物的组织培养技 术,加快优良鸢尾属植物资源直接利用的进程,并为生产实践提供一定的参考。 6 第二章鸢尾属植物组织培养技术的研究 1溪荪的组织培养技术的研究 1.1材料与方法 1.1-1实验材料 实验材料取自南京莫愁湖公园,取材时间为2004年及2005年的春季。以溪 荪春季萌发植株的茎尖和幼叶为外植体。 1.1.2实验方法 1.1.2.1外植体的选取 (1茎尖 选择露地栽培生长旺盛的溪荪春季萌发的幼龄植株,用铲子和利刀将其从田 间挖出,迅速放入事先准备好的牛皮纸信封中,做好标记。 (2)幼叶 选择露地栽培生长旺盛的溪荪春季萌发的幼龄植株(如图2.1所示),用剪 刀剪取其幼叶,迅速放入事先准备好的牛皮纸信封中,做好标记。 l_1.2.2接种前外植体的处理 (1)茎尖处理 将从田问取回的植株用自来水冲洗净泥土,用手术刀去须根和叶,注意保留 距茎尖约1cm的材料。先用10%的洗涤剂水溶液浸泡并搅拌消毒10miⅡ,再用 自来水冲洗干净,直至无泡沫为止二置超净台上,修整切去外皮后用75%的酒 精溶液浸泡2min,用无菌水冲洗3次,再用0.1%的氯化汞溶液消毒7min,最 后用无菌水浸泡15min,在浸泡时间内需经常搅动并换水3~4次。将材料取出 后放置于培养皿的无菌纱布上,吸去多余的水分。(2)幼叶处理 将从田间取回的幼叶用自来水冲洗干净,先用10%的洗涤剂水溶液浸泡并 搅拌消毒lOmin,再用自来水冲洗干净,直至无泡沫为止。置超净台上,在75 %的酒精溶液中蘸取5s,用无菌水冲洗3次,再用0。l%的氯化汞溶液消毒2min, 最后用无菌水浸泡15min,在浸泡时间内需经常搅动并换水3~4次。将材料取 出后放置于培养皿的无菌纱布上,吸去多余的水分。 1.1.2.3外植体的接种 (1)茎尖 将近茎尖区域的组织切成约2mm×2mm×2mm大小的外植体块,接种在准 备好的培养基上,用镊子将材料略微下按,使其整体的l/3包埋在培养基中。 (2) 幼叶 用手术刀将其切成长lcm,宽0.5cm的薄片,平铺或斜插在事先准备好的 培养基内。 图2.1溪荪春季小苗 图2.2溪荪幼叶为外植体 The The leavesof打括 Fi92.1 youngseedIingof打括j口增“加P口inspringFi92.2 young s4”g“抽P口asexplants 1.1.2.4不定芽的诱导与分化 高压灭菌25min。培养温度为25℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lx。 细胞分裂素选用6.BA,生长素选用NAA。设计如下浓度: 6一BA处理:O.5,1.O,I.5,2.O(mg/L) NAA处理:O.1,O.2,0.5,1.0(mg,L) 将6一BA和NAA按两因素正交设计相配合,共有16个处理,每处理重复25 次。 1.1.2.5不定根的诱导与移栽 外植体的芽生长至5cm时,选取生长旺盛的芽丛,将单个不定芽从不定芽 丛上分离下来,移植于生根培养基上。依然选用MS培养基为基本培养基,设计 如下浓度: 6.BA处理:O.1,O.2,O.5,1.O(mg/L) NAA或IBA处理:O.2,O.5,1.0(mg,L) 按两因素正交设计相配合,共有24个处理,每处理重复25次。当苗生根后 保持湿润。 1.2结果与分析 1.2.1取材部位对诱导分化的影响 根据植物组织培养的特点,在外植体的选取中,多选用那些幼嫩的组织或器 8 官以提高组培的成功率。在前人的研究中,多是以鸢尾植物幼嫩的茎尖【3‘】或芽【26j 为外植体,同时也有选择花器官为外植体的。本实验在借鉴前人经验的基础上, 也尝试以幼嫩的叶片为外植体进行组织培养,在实验中不同外植体对诱导分化的 影响不尽相同,具体情况如下: 取材部位对诱导分化有很大的影响(表2,1),可以看出,当以叶片为外植体 时,无论接种在哪种激素配比的培养基中均无不定芽形成,随着培养实践的延长, 叶片出现枯黄,直至死亡。这与花菖蒲组织培养中遇到的情况相同,经过分析, 这主要是由于鸢尾属植物的叶片均有不同程度的纤维化,降低了其叶片的活性, 使其难于诱导成功。而以茎尖为外植体时,得到了较好的结果,在多种激素配比 的培养基上诱导分化成功。由此可见,溪荪茎尖的分生能力较强。 I.2.2激素浓度及其配比对诱导分化的影响 实验中以MS培养基为基本培养基,同时添加不同浓度的细胞分裂素(6.BA) 度的6.BA反而不利于诱导分化:另外,适当浓度的NAA含量对诱导频率也有 很大的影响,从表2.1,2.2中均可以看出过高浓度的NAA抑制了芽的诱导增殖, 当6.BA浓度一定时,NAA的浓度达O.5~1.Omg,L时,诱导频率显著降低。 NAA0.2mg/L的激素浓度◁☆●•○△组合,不定芽的诱导频率最理想,达到70%,接种四周 后,平均每芽分化的不定芽个数达2.75。 表2.1培养基和取材部位对诱导分化频率的影响 Table2.1Effectofthedifferentmedium8nd ofscaIestodifferent㈨on parts frequency O 5 0 l O 5 02 O5 O5 0 5 l O l O 0 l 1 O 02 1 0 O 5 l 0 l 0 1 5 O 1 l 5 0 2 1 5 O 5 1 5 l O 巧”笛M””嬲”””巧 如”如如酪如”如们如如如 2.O 0.1 25 25 2.O O.2 25 20 2.0 0.5 25 10 2.0 1 0 25 O 0 接种4周后的观察结果 (Theresultaner4weekscuIture) 表2.2培养基和外植体块大小对诱导分化的影响 TabIe2.2 Effectofthedifferentmedium of andsize tOdiff▼▲erentiat{on explants frequency 10 1.2.3外植体块大小对诱导分化的影响 在实验中还发现,当以茎尖为外植体时,所切割的外植体块的大小对诱导分 化也产生较大的影响,外植体块小于1mm×1mm×1mm时诱导分化的频率很低: 外植体块大于3mm×3mm×3mm时诱导分化的频率也较低;外植体块大小以 2mm×2mmx2mm时效采最佳,诱导频率最高可达l80%(表2.2)。分析其差异 质也非常少,且再切割时会对其产生不同程度的伤害,令其难于回复,进而产生 了大量的酚类物质进行自我保护,这样就抑制了激素对其的诱导作用;当外植体 块过大时,其细胞的脱分化效果不良,最终导致了较低的分化率。 图2.3适宜大小的茎尖为外植体 图2.4过大的茎尖为外植体 1.3结论与讨论 1.3.1植物激素对外植体诱导分化的调控作用 激素对细胞的分化起着重要的调节作用,生长素和细胞分裂素的比例控制着 细胞的分化和器官的形成,高质量浓度细胞分裂素与低质量浓度的生长素有利于 芽的形成:反之则促进生根l3I】。在本实验◆■中,1.Omg/L的6.BA是溪荪芽分化增 殖的最佳浓度。过高浓度的6一BA反而不利于甚至抑制诱导分化。生长素的用量 对不定芽的分化也起着关键的作用,较低浓度(0.2mg/L)的NAA配方可以使 溪荪获得较理想的芽分化率。综上所述:溪荪茎失培养中诱导和增殖最佳培养基 配方为:MS+6一BAl.Omg,L+NAAQ.2mg,L。 1.3.2植物生长调节剂对试管苗生根的影响 一般来说,在根培养阶段,大多数植物生根都需要激素,尤其是生长素,常 用的生长素有NAA和IBA两种。不同种植物生根所需要的生长素种类和用量都 各不相同。有研究认为,IBA的生根作用强烈,维持时间长,所引起的根多而细 长,而NAA引起的根数目少而粗壮【53】。在本实◆◁•验的生根阶段,分别加入了NAA 和IBA两种生长素,其中NAA对溪荪生根效果最好,以0.5mg/L的浓度最佳。 +NAA0.5mg/L为最佳。 2鸢尾的组织培养技术灼研究 2.1材料与方法 2.1.1实验材料 实验材料取自南京林业大学校园,以鸢尾的茎尖和花器官为外植体。取材时 花器官为4~5月。 2.1.2实验方法 2.1.2.1外植体的选取 (1)茎尖 选择露地栽培生长旺盛的鸢尾春、秋两季植株,用铲子和利刀将其从田问挖 出,迅速放入事先准备好的牛皮纸信封中,做好标记。 (2)花器官 选择露地栽培生长旺盛的鸢尾植株,在花蕾未打开时切取5cm左右的花梗 及其上部的花蕾,迅速放入事先准备好的牛皮纸信封中,做好标记。 2.1.2.2接种前外植体的处理 (1)茎尖处理 将从田间取回的植株用自来水冲洗净泥土,用手术刀去须根和叶,注意保留 距茎尖约lcm的材料。先用10%的洗涤剂水溶液浸泡并搅拌消毒10min,再用 自来水冲洗干净,直至无泡沫为止。置超净台上,修整切去外皮后用75%的酒 后用无菌水浸泡15min,在浸泡时间内需经常搅动并换水3~4次。将材料取出 后放置于培养皿的无菌纱布上,吸去多余的水分。 图2.5鸢尾的花苞 图2.6鸢尾花瓣为外植体 flowerbuds The of打拈fPc,D,“胧 The of加括把cf。r”脚as Fi92.5 Fi92.6 petals explants 12 (2)花器官 将从田问取回的花蕾剥去两片苞片,得到两枚花苞。先用10%的洗涤剂水 浸泡并搅拌10min,再用自来水冲洗干净,直至无泡沫为止。置超净台上。用75 %的酒精蘸取lOs,用无菌水冲洗三次,再用0.1%的氯化汞溶液消毒2~3min, 最后用无菌水浸泡15min,在浸泡时间内需经常搅动并换水3~4次。将材料取 出后放置于培养皿的无菌纱布上,吸去多余的水分。 2.1.2.3外植体的接种 (1)茎尖 将近茎尖区域的组织切成约2mm×2mm×2mm大小的外植体块,接种在准 备好的培养基上,用镊子将材料路微下按,使其整体的I/3包埋在培养基中。 (2)花器官 花器官的接种分为花梗、花托及花瓣三种情况。切取1cm左右的花梗、花 托,按极向摆放;花瓣则切取O.5×O.5cm2大小的部分,将以上三部分分别接种 于适当的培养基上进行诱导。 2.1.2。4不定芽的诱导与分化 高压灭菌25邢in。培养温度为25℃,光照时问12h,d,光照强度2000Lx。 细胞分裂素选用6.BA,生长素选用NAA或IBA。设计如下浓度: 6.BA处理:0.5,1.O,1.5,2.0(mg/L) NAA或IBA处理:O.1,O.2,0.5,1.O(mg/L) 按两因素正交设计相配合,共有32个处理,每处理重复25次。 2.1.2.5不定根的诱导与移栽 外植体的芽生长至5cm时,选取生长旺盛的芽丛,将单个不定芽从不定芽 丛上分离下来,移植于生根培养基上。依然选用Ms培养基为基本培养基,设计 如下浓度 6一BA处理:0.1,O.2,0.5,1.0(mg/L) NAA或IBA处理:O.1,O.5,1.O(mg,L) 按两因素正交设计相配合,共有24个处理,每处理重复25次。当苗生根后 保持湿润。 2.2结果与分析 Z.2.1取材时期对诱导分化的影响 lO月)两季采取其茎尖进行诱导分化,通过大量的实验,结果表明:春季采得 季采得的茎尖则没有愈伤组织的产生。在实验的过程中,为了使得秋季茎尖成功 地诱导分化。采取了加大细胞分裂素浓度的方法,将6一BA的浓度提高至 3.0mg/L,但仍未取得预期的效果,反而在茎失周围产生了大量的褐化物质。 图2.7春季茎尖培养得到的鸢尾小苗 图2.86一BA浓度为3.omg/L时外植体褐化 The 5fgcfDr”掰 under plant。f打f Fi92.8Explantsbrowning6一BA(3。Omg/L) Fi92,7 young its in by shootingtip spring 2.2.2不定芽的增殖培养 在本实验中,当不定芽形成后,暂时不切割,而是将其转接于增殖培养基上, 继续培养25~30天。在预实验中,尝试了在增殖培养基中加入适量的KT,实验 结果表明,在所有的培养基配方中,鸢尾不定芽增殖最优培养基为Ms+ 小的不定芽丛不宜切割,需切割时最好采用不定芽间分离或剥离的方式进行,最 低程度地减少损伤,以免影响不定芽的增殖13”。 6.BA的浓度对鸢尾芽的增殖起着关键的作用,当6一BA的浓度在1.Omg几 时,不利于芽的增殖,而过高浓度的6一BA,即当6一BA的浓度高于1。5mg/L时, 反而抑制芽的增殖,试管苗易出现褐化现象,也有少量玻璃苗的产生。 细胞分裂素KT对鸢尾芽的分化增殖也有较理想的效果,在附加KT的培养 基中,不定芽的分化数目和分化率都很高。在实验中,同等条件下加入KT与未 加入KT相比,平均每芽分化数和分化率都有所升高,说明KT的加入促进了鸢 尾芽的分化增殖(表2.3)。 14 表2.3培养基增殖速度的影响 Table2.3 EffectofthedifferentmediumofadVentitiousbudsto rate proliferated 2.2.3花器官的诱导 在花器官的诱导中,将采来的花蕾未打开的整个花枝分成三种情况进行处 理,即花梗、花托、花瓣。因为以上三者都较幼嫩,所以在清洗、消毒时都要格 外注意,尤其是在消毒时间的把握上,在经过75%的酒精消毒这一步骤时,一 律采用蘸取式的消毒方式,时间控制在10s以内。在接种时,花梗部分要注意极 向,按照极向摆放整●齐,避免混乱。 将消毒好的花梗、花托、花瓣直接接种于诱导芽的培养基中,经过30天的 培养,仍未观察到有愈伤组织的产生,只是材料有变大变厚的情况,将材料从培 养基中取出,置于超净台上的培养皿中,用手术刀片切割,感觉到材料明显变硬, 并含有大量的水分。 在预实验中曾尝试加大细胞分裂素6.BA的浓度至4.Omg,L,但仍未达到想 要的结果,在花器官的诱导中没有愈伤组织的产生。 2.3结论与讨论 2.3.1植物激素对不定芽分化增殖的调控 在鸢尾的组织培养中,经诱导产生的单生芽,开始分化时只形成1~2个丛 芽,随继代培养次数的增加,丛芽增殖倍数会有所提高[★-●=•▽2…。为了观察激素浓度 的变化及配比对丛芽增殖的影响,在预实验的基础上,设计了8个组合的实验。 结果表明:当6一BA浓度一定时,增殖倍数随NAA浓度的提高而降低(表2.3)。 为优,在实验中还发现,过高浓度的6.BA C高于3.Omg/L)反而抑制丛芽的增 殖。 细胞分裂素在芽的增殖过程中也起到很大的作用,浓度的选择是关键所在, 同时,添加其他种类的细胞分裂素,如KT,也会对芽的增殖产生促进作羽。当 照相比,增殖系数有显著的提高,从未添加KT时的2.8增加到4.4。从实验结 果中可以看出,两种以上的植物激素配合使用,效果会更佳。 2.3.2试管苗的玻璃化现象 玻璃苗是植物组织培养中出现的呈半透明状、畸形的试管植物,它不能移栽 成活于土壤或其他人工基质中”…。玻璃化是植物组织培养中特有的现象,在自 然环境中的陆生植物未见有玻璃化现象的存在。众多研究表明,玻璃苗绝大多数 来自茎尖或茎段培养物的不定芽,仅仅极少数玻璃苗来自愈防组织的再生芽。玻 璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。 在本实验中也有少量玻璃苗产生,经过分析,这主要是由于激素浓度增加尤 其是细胞分裂素浓度提高而导致的。细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化,打 破顶端优势,促进腋芽发生。在实验中,当细胞分裂素为适宜的浓度(1.O~ 1.5mg/L)时。可避免玻璃苗的产生。 3花菖蒲的组织培养技术的研究 3.1材料与方法 3.1.1实验材料 由南京莫愁湖公园提供,本实验选择了10个不同花菖蒲品种,分别以幼嫩 的叶片、茎尖及花器官为外植体,取材时间为2004年及2005年的4月和6月。 3.1.2实验方法 3.1.2.1外植体的灭菌 (1)幼嫩叶片 选择露地栽培生长旺盛的花菖蒲春季(4月初)萌发的幼龄株叶片为材料, 将其从田间取回,用自来水冲洗净泥土。先用lO%的洗涤剂水浸泡并搅拌消毒 10min,再用自来水冲洗干净,置超净台上。消毒液的选取与消毒方式为: ①75%酒精5 2m s+O.1%Hgcl2 2m ②O.1%HgCl2 3m @75%酒精7s+o.1%Hgcl2 (D 5m 75%酒精10s+O.1%Hgcl2 (2)茎尖 选择露地栽培生长旺盛的花菖蒲春季(4月初)萌发的幼龄株(此时叶片 高度应在5cm左右)茎尖为材料,用自来水冲洗净泥土,用剪子去除须根和叶 片,注意保留距茎尖约lcm的材料。先用10%的洗涤剂水浸泡并搅拌消毒10min, 再用自来水冲洗干净,置超净台上。消毒方式为: 10m ①75%酒精5m+0.1%Hgcl2 8m ②75%酒精3m+0.1%Hgcl2 8m (萤75%酒精2m+0.1%Hgcl2 (D 5m 75%酒精Im+O.1%Hgcl2 (3)花器官 选择露地栽培生长旺盛的花菖蒲花器官(幼嫩的花苞)为材料,剥去两片苞 片,得到两枚花苞。先用10%的洗涤剂水浸泡并搅拌lOmin,再用自来水冲洗干 净,置超净台上。消毒方式为: 2m ①75%酒精10s+O.1%Hgcl2 3m ②75%酒精lOs+O.1%HgCl2 3.1.2.2无菌材料的处理与接种 (1)幼嫩叶片 用手术刀将其切成长1cm,宽0.5cm的薄片,平铺或斜插在事先准备好的 培养基内。 (2)茎尖 种在准备好的培养基上,并略微下按,使其整体的l/3包埋在培养基内。 (3)花器官 将其切成长宽均为1cm的小块,接种在准备好的培养基上,并略微下按。 图2.9花菖蒲的花梗培养 图2.10花菖蒲的花瓣培养 9Theculturcof of“b Thecultureof Fi92 explants Fi92.10 petaIsIexplants pedicel t口e嘶rf otIris kae阱0eri 3.1.2.3培养基组合优化实验 本实验的所有组合均采用MS为基本培养基,在植物激素的筛选中发现6一BA 和NAA较其他激素好。在植物激素的配比中,设计如下浓度: 6一BA处理:1.01.5 2.0 2.5(mg/L) NAA处理:O.10.2 O.5 1.0(mg/L) 将6.BA和NAA按正交设计相配合,共有16个处理,每处理重复25次。 17 培养温度为25℃,光照时间12}1/d,光照强度2000Lx。 3.2结果与分析 3.2.1消毒液及消毒方式对无菌外植体得率的影响 实验结果表明,不同消毒液及消毒方式很大程度地影响无菌无性系的建立, 见表2.4: 表2.4不同消毒方式对幼叶的影响 TabIe2.4 with Ef诧ctofIeaVesdiffcrentof typeantisepsis 2m 注:I一75%酒精5s+0.1%Hgclt II一0.1%HgCl{2m III一75%酒精7s+0.1%Hgcl。3m z 5m IV一75%酒精1Os+0.1%HgCl 表2.5不同消毒方式对茎尖的影响 Table2.5EffectOfstem withdifferentof apex typeantisepsis z 10Ⅲ 注:I一75%酒精5Ⅲ+0.1%Hgcl II一75%酒精3m+0.1%Hgcl。8m III一75%酒精2m+0.1%Hgclz 7m Iv一75%酒精1Ⅲ+0.1%Hgcl2 5口 18 表26不同消毒方式对花苞的影响 Table2,6E恐c£oftlowerbudw淌differentOf typean£isepsis 注:I一75%酒精l0s+O.L%Hgclz 2Ⅲ II一75%酒精10s+0.1%Hgcl2 3m 随着消毒时间的加长,污染率降低而死亡率升高。另外,在实验中也尝试单独使 酒精作几秒钟的短暂灭菌虽然降低了死亡率,但同时也提高了污染率,最终获得 的有效外植体得率不及使用75%酒精+0.1%Hgcl2的消毒方式高。 从表2.5可以看出,在茎尖消毒中,采用I消毒方式,即用75%酒精消毒 43.8%,无菌外植体的得率为48.8%;而消毒时间最短的IV消毒方式,即用75 降低到16%,无菌外植体的得率为53.3%;从有效外植体的得率高低来看,采 到70%以上。 对于花器官丽言,由于实验中选取的是幼嫩的花苞,本身就较干净,消毒也 相对容易。从表2.6可以看出,实验中采用的两种消毒方式均得到了高达90%以 上的无菌外植体。 3.2.2不同部位外植体诱导分化状况 以花菖蒲幼嫩的叶片及花器官做外植体时,在16个处理中均未产生愈伤组 织;以茎尖做外植体时,当培养基为Ms+6.BA 2.5mg儿+NAAO。1mg儿或 NAAO.2mg/L.有少量的愈伤组织产生,但很快变褐变硬;在实验中,当6一BA 的浓度为1.O mg/L、1.5mg/L、2.Omg/L时,在茎尖培养中均没有诱导分化现 象的产生。若提高6.BA的浓度至3.Omg/L、4.0mg/L时,仍得不到愈伤组织。 3.2.3激素浓度对茎尖培养的调控 在实验中.我们发现激素的浓度,尤其是细胞分裂素的浓度对花菖蒲茎尖培 养产生至关重要的作用,对茎尖诱导分化影响较大。而生长素NAA的浓度为 0.1mg/L和O.2m昏L时,对茎尖培养的差异不显著,说明两种浓度的培养基对茎 尖培养影响不大。在预实验中分别添加了zT和KT两种细胞分裂素,其浓度分 2.5mg/L。但二者对花菖蒲茎尖诱导分化的效果均不理想。并未表现出促进愈伤 组织形成的作用,仍以MS+6一BA 2。5mg/L+NAA 培养基为最佳。 3.3结论与讨论 3.3.1消毒时间对外植体材料的影响 在组织培养中,外植体的消毒工作对后面实验的顺利进行有很大的影响,主 要有两个方面,一是消毒液的选择,二是消毒时间的确定。常用的消毒液有O.1 %HgCl2及75%酒精,由于酒精具有很强的渗透性,在使用中消毒时间的把握尤 其重要,对于较幼嫩的部分,如幼叶、花苞等,要采用蘸取的短暂消毒方式,否 则就会造成很高的死亡率,当以茎尖为外植体时,可适当延长使用75%酒精消 毒的时间,但也不寅过长,消毒时间要严格控制在5min以内,以2~3min为最 佳。外植体消毒以后接种之前要用无菌水清洗浸泡,换水4~5次,然后将外植 体放在事先准备好的无菌纱布上,将外植体上多余的水分吸干,再行接种。当以 幼叶为外植体时,最佳的消毒方式为:75%酒精蘸取5s再用0.1%HgCl。浸泡 %Hgcl:浸泡7min;以花器官为外植体时,最佳的消毒方式为:用75%酒精蘸 取10s,再用O.1%Hgcl。浸泡2~3min。 3.3.2外植体的褐变及防治措施 褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以 致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变在植物组 织培养过程中普遍存在,这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三 大难题1431。 在以花菖蒲的茎尖为外植体进行实验是,材料四周或材料本身都有褐变现象 的发生,为了克服外植体的褐变。在实验中采取了频繁转瓶、在培养基中添加吸 附剂的做法。但效果均不明显。 在频繁转瓶的过程中:不但大大增加了工作量,而且容易造成个别材料的污 咯烷酮)是酚类物质的专一吸附荆。在生化分离制各中常用作酚类物质和细胞器 的保护剂,因此Pvp被许多学者用于防止褐变.然而,在本实验中PVP几乎没有 防止褐变的效果,原因是在植物体内存在着不同的酚类物质,而PVP也存在不 同分子量的类型15…。 20 4总结与展望 4.1总结 利用组织培养技术快速繁殖鸢尾属的部分植物是有效解决其播种繁殖系数 低、生产周期长、市场需求越来越大等问题的最佳途径。通过对三种鸢尾属植物 的组织培养技术的研究,尝试了采用幼叶、茎尖、花器官等多种材料做为外植体, 从材料的灭菌、切割到接种,以及激素配比等,试图探讨出最优的快速繁殖方法。 在进行植物组织培养时,外植体的类型、选取时间及部位对实验的成败起到 了决定性的作用。本实验在外植体的诱导分化中以茎尖的发生能力最强,以幼叶 和花器官为外植体时均未诱导分化。 外植体的消毒方式根据所选择外植体的类型而有很大差异,尤其采用75% 的酒精做为消毒液时,要严格控制消毒时间,否则会造成材◆▼料的损伤甚至死亡。 以幼叶和花器官为外植体时只需在酒精溶液中蘸取几秒钟即可,但在以茎尖为外 植体时,则需在酒精溶液中浸泡2min左右,时间过短则消毒不彻底,造成材料 的污染,时间过长则会使材料死亡。 植物激素种类和用量的选择因组织培养的目的、植物材料的种类来确定15“。 不同种植物材料茎尖诱导分化所需的激素浓度不一样,溪荪以MS+ +NAA0.1mg/L的培养基的效果最佳。 到目前为止,组织培养过程中的褐变现象研究已进行了几十年,积累了大量 的资料,也提出了各种假说。但我们还是不能确切的阐述组织培养褐变的详细过 程。通过对褐变现象研究状况的回顾和了解,我们可以得到以下共识;组织培养 褐变是酚类物质被氧化的结果,其中PPO能促进褐变的发生.引起褐变的因素是 复杂的,就内因来讲,外植体材料的生理状态、基因型、同一基因型的不同栽培 条件、营养状况、生长部位和大小都会影响褐变的发生.就外因而言,培养基的 成分、外加激素的含量及比例、培养条件(温度、光照时间、光照强度、通气状 况等)等也会影响褐变的发生,褐变的发生往往是多种因素同时作用的结果.在 导致褐变的诸多因素中,膜结构的破坏或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物 质的酶促氧化和组织发生褐变的关键。因此,深入了解有关机制对于从理论上认 识组织褐变。找到影响褐变的主导因子和克服褐变的•□▼◁▼有效方法,并从实践上防止 褐变的发生,对解决组培生产过程中的褐变这一难题,促进组培技术的日臻完善, 具有重要的理论和现实意义。 4.2展望 鸢尾属做为鸢尾科中最大的一个属,其属下植物遍布于亚洲、欧洲和北美洲 等地区,生态幅非常广范【91。鸢尾属植物多数都具有美丽的花朵,青翠似剑的叶 片,观赏价值极高。在园林中的应用形式也是灵活多样,可丛栽、盆栽布置花坛、 栽植于浅水区、河畔池旁,也可布置专类园,也可植于林荫树下作为地被植物。 2l 不紧如此,其在香料、药物、食品等方面也表现出了重要的作用。随着鸢尾属植 物应用范围的日益扩大,对其优良种苗醣需求量也不断增加,而传统的播种及分 栋繁殖方式已不能满足币场对鸢尾植物的需求,因此,更需要系统的研究鸢尾属 植物的组织培养技术。通过文的研究结果表明,在组织培养方面还有以下问题有 待进一步的研究: 在外植体的选取中,虽以茎尖为最佳,但其采样及消毒灭菌等过程都给实验 操作带来许多不便。而以花器官为外植体时,材料不坦容易获得,且因选择的均 为幼嫩的花苞,不易被病菌感染,所以消毒灭菌的工作也较方便。但在本实验中 花器官诱导未获得成功,所以还有待迸一步的研究。 愈伤组织诱导过程中,有大量褐化现象的产生,在实验中采取了适当降低细 胞分裂素的浓度、添加吸附剂、频繁转瓶等措施,但效果均不理想。有研究表明, 可以通过调节培养室的温湿度及光照强度来减轻褐化问题,在本实验中由于条件 所限并未进行这方面的处理,还有待今后进一步的研究。 花菖蒲的组织培养中,未得到大量的愈伤组织,虽已将6.BA的浓度提高到 2.5m2/L,也只是有少•☆■▲量愈伤组织的产生。有研究表明.在培养基中添加过高浓 度的6.BA不但会产生试管苗的玻璃化现象,还会抑制外植体的诱导,这与本实 验的研究结果相同,要想解决这一矛盾,还需今后大量的实验探索。 下篇鸢尾属植物耐荫性的研究 第一章文献综述 密度)条件下的生活能力。这种能力是一种复合性状。植物为适应变化了的光量 子密度而产生了一系列的变化,从而保持自身系统的平衡状态,并能进行正常的 生命活动p…。 l植物耐荫性研究机理哺 遮荫是使植物产生光量子密度限制的环境或人为因子。一般而言,遮荫是指 植物在足够长的时间内生活在非饱和光量子密度(光限)条件下。遮荫可以是永久 性的,如在热带雨林中;可以是季节性的,如在落叶林或建筑的周围;也可以是 不规则的,如林内光斑期对植物的影响等。在遮荫的条件下,植物一方面通过增 强充分吸收低光量子密度的能量,提高光能利用效率,使之高效率地转化为化学 能;另一方面降低用于呼吸及维持其生长的能量消耗,使光合作用同化的能量以 最大比例贮存于光合作用组织中等途径来适应低光量子密度环境,维持其正常的 生存生长。 1.1保持吸收光量子的最大能力 植物对低光量子密度环境的适应,首先表现在其形态上,其次出现栅栏组织 退化、叶绿体的运动阻及色素含量的变化。耐荫植物与喜光植物相比,其叶片具 有发达的海绵组织,而栅栏组织细胞极少或根本没有典型的栅栏薄壁细胞 【58,59,60,611,这是植物耐▲★-●荫的解剖学机理之一。柱状的栅栏组织细胞使光量子能够 透过中心液泡‘62】或细胞间隙158】造成光能的投射损失。因而,相对发达的海绵组 织不规则的细胞分布对于减少光量子投射损失,提高弱光照条件下的光量子利用 效率具有十分重要的意义。 叶绿体层的形成是通过栅栏组织细胞的形状调节完成的。耐荫植物的叶绿体 呈狭长的串状或连续的层状分布【6”,这种结构可以通过减少光量子穿透叶片的 量而降低“筛效应”。叶绿体通过方向与叶内光量子分布(光梯度)相一致的运动, 使其能更充分地利用透入叶片的光量子,从而使光合作用尽可能地完善起来 [64,651 O 叶绿素是植物的光合色素,具有吸收和传递光量子的功能。叶绿素含量随光 量子密度的降低而增加,但叶绿素a/b值却随光量子密度的降低而减小【6饥67J。低 的叶绿素a,b值能提高植物对远红光的吸收f66,6引。因而在弱光下,具有较低的叶 绿素a/b值及较高的叶绿素含量的植物也具有较高的光合活性【69】。 23 1.2提高光能利用效率 在遮荫条件下,保持较高的光能利用效率对植物生长以及许多有关的生物化 学、生理和形态过程都是至关重要的。因而,在遮荫而岳致的光照不足情况下, 植物光合作用曲线变化就是一种重要的植物光能利用效率的反应。同时,吸收量 21。 子效率和光合作用单位(pSU)直接影响着植物光合效率的高低【70t71,7 1.3减少能量消耗 植物消耗能量的过程包括光呼吸和暗呼吸。比较研究I73】表明,耐荫植物叶 片及根的呼吸强度均较喜光植物低。一方面,耐荫植物叶片的暗呼吸较弱,因而 整个光一光响应曲线向左移动,光补偿点出现在更低的光量子密度下;在超过补 偿点的光量子密度下,降低RubiscO水平,使其加氧酶活性降低,少产生或不 产生光呼吸的底物一磷酸乙醇酸17“。另一方面,遮荫条件下植物根呼吸降低, 可能是由于遮荫小区的土壤温度降低时所致根量相对减少的结果。 2植物耐荫性的研究现状 植物生态学中根据植物生长对光照强度的关系,将植物分成◇•■★▼三种类型:阳性 植物、阴性植物和耐阴植物(中性植物),耐阴植物在充足的阳光下生长最好,但 亦有不同程度的耐阴能力,在高温、干旱、全光照下生长受抑制。植物生长的弱 光照条件通过遮荫来实现。遮荫是使植物产生光量予密度限制的环境或人为因 子。一般而言,遮荫是指植物在足够长的时间内生活在非饱和光量子密度条件下。 植物的耐萌性由两方面决定,一是植物本身具有的遗传学上的特性,二是植 物对外界变化的光照条件的适应性。植物对低光量子密度的反应,一般表现为两 种类型:避免遮荫和忍耐遮荫。具有避免遮荫能力的植物,当轻度遮荫时,叶片 做出很小的适应调节,同时降低径生长并加快高生长,以早日冲出荫蔽的环境; 但当遮荫增大时,则很难对新的光环境做出反应,表现出黄化现象或最终被耐阴 植物取代。忍耐遮荫在顶端群落的中下层植物以及部分阳性植物的叶幕内部或下 层叶片上表现比较突出。具有忍耐遮荫能力的植物,其叶片形态特征与低光量子 密度的光环境极为协调,从而保证植物在较低的光合有效辐射范围内有机物质的 平衡为正值【6…。这种对低光量子密度的适应,包括了生理生化及解剖上的变化, 如色素含量、RuBP梭化酶活性以及叶片栅栏组织和海绵组织的比例关系、.叶片 大小、厚度等的改变¨”。 2.1国外对植物耐荫性的研究 国外对植物耐荫性的研究是和光合作用研究密切相联系的,从五十年代初期 至今分别从光对植物形态、叶片解剖结构、叶绿○▲-•■□素的含量、叶绿体的数量、形态 和大小的影响和植物体各器官的光学性质、光谱组成对光合器官的作用及植物二 氧化碳气体交换、酶的活性、激素含量和电子传递链等方面进行了深入细致的研 究,从植物的外部形态到内部构造对光照的反映及其内部机理进行了规律性的总 结。Abram.M.D【76】对31种阔叶和针叶树种的叶片解剖结构、光合特性进行研究 并划分出不同耐荫程度的树种;DubasEetal【7”总结了悬铃木在遮荫条件下发生 的形态学和光学特性的变化。采列尼克尔【7s对植物的观察表明,喜荫植物的树 冠多呈圆锥形、树皮较薄、茎尖变长、其大叶子的分布几乎都在没有透光的小枝 上、多水平分布;在叶面积上,遮荫下及阴生叶的叶面积均大于全光照下及阳生 叶的叶面积,植物对光的这种适应,有助于同化有机物质的积累和呼吸消耗的降 低,他还对桦、槭、七叶树进行研究,发现3年生苗在全光的30%、18%、4% 的光照环境中,侧枝和小枝数量比照全光环境分别降低了7%、37.5%、24%和 75%、75%、46%,这种形态上的变化是树木适应环境的关键,通常具有较高分 枝率的枝系统有利于强光下树冠对辐射的截获,而低分枝率的枝系统则可以使树 荫条件下的叶片解剖结构进行比较研究时发现:庇荫环境下的植物叶片具有较低 的比叶重、叶片厚度、气孔密度和栅栏组织/海绵组织比值,气孔较大,叶绿素 的体积增大,基粒中单位体积的垛叠片层密度提高,捕光叶绿素含量提高等特征。 skene在对成熟苹果叶片在不同光照条件下的叶绿体结构研究中发现:不同光照 程度下叶片叶绿体结构不同,由全光环境到适度遮荫,叶绿体由基质类囊体占优 势转为基粒类囊体占优势,基粒细胞的大小随光梯度的减小而增大。Drew曾在 对水草的形态学和解剖学研究过程中提出光合作用对叶绿素含量呈线性关系,而 组织一叶绿体(P.chits)的光合系统I电子传递能力及量子效率均高于海绵组织 效率相对较高,指出了植物体内电子传递活性直接关系到叶绿素含量,并进一步 T.C从细胞生物学的角度研究了光照条件的不同对植物细胞的渗透压、膨压和胞 间c02扩散阻力的影响【”J。 2.2国内对植物耐荫性的研究 我国对植物耐荫性的研究始于20世纪70年代末。早在1976年苏雪痕157J教 授I“】就开始对杭州植物群落中生长的毛自杜鹃(R^o咖出n办o肌“c,o拧口f“历)山 发育情况及光合作用特性等做了初步的研究,提出了园林植物耐荫性及配置的理 论【84】。陈有民先生对华北地区常见的乔木耐萌能力做了经验性的排序,并指出 判断树木耐荫性的方法包括生理指标法和形态指标法【791。北京市园林科学研究 所在调查北京市区55种树木适应性的基础上,对其应用进行了评述【s01,划分为 强耐荫植物、强阳性植物和耐半荫植物3类。 广州园林科学研究所【▽•●◆81】、中科院植物研究所【82】分别对广州常见的32科一室内 观叶植物进行了不同光照条件的研究,认为单位面积鲜质量、干质量、单叶面积、 叶片解剖构造、生长量及光合作用特性与耐荫程度相关,并对一些植物的耐荫性 做了等级划分。 陈绍云【8纠认为叶绿素总量及叶绿素“b值与植物耐荫性具有一定的相关性。 罗宁【79】通过对8种室内观叶植物叶片的解剖构造观测,分析了阴生结构与耐荫 性的关系。白伟岚悼4J通过对50种植物的光合特性曲线的分析,认为光补偿点、 光饱和点是评价植物耐荫能力大小的可靠指标,而叶绿素含量及叶绿素a/b值的 高低与耐荫能力相关规律有待于进一步的研究;同时对8种较耐荫的植物进行了 盆栽人工控制光强的光合作用研究H”。 尹淑霞【”】选择多年生黑麦草r尸fc枷f以),草地早熟禾(胁rfr),粗茎早熟禾 品种,分别在全光照下和遮荫60%条件下测定5种草坪革的出苗和成坪情况、地 上部分生长速率、光补偿点、草坪草分蘖枝数、叶绿素含量及叶绿素a/b值、叶 片含水量、比叶重等7个指标,并每月对各小区草坪的整体表现和品质进行综合 评分。 朱云华【86】针对南京地区的气候特点、绿化现状,结合南京地区地被植物种 质资源调查,筛选出12个优秀种,经过一年半地☆△◆▲■栽培、养护管理,详细地观察了 它们的生物学特性、扩繁能力、观赏价值。并对这12种冬绿地被植物的耐寒性和 耐荫性作了定量地分析,为今后在南京及以北地区使用冬绿地被植物提供理论依 据。 许实【871研究了10种室内观赏植物的光合特性,对植物的耐荫性进行排序, 进而探讨了植物的耐

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